Советуем для ознакомления:

Разделы генетики:

Популярные разделы сайта:

Оглавление темы "Проект геном человека. Векторы.":
1. Синдром Беквита—Видемана. Причины синдрома беквита—видемана. Потеря импритинга.
2. Значение геномного импритинга. Наследственные заболевания и геномный импритинг.
3. Механизм импритинга. Модели смены эпигенотипа хромосом.
4. Проект геном человека. Технология рекомбинантных ДНК.
5. Клонирование ДНК. Этапы клонирования днк. Рестрикционные ферменты. Рестриктазы. Эндонуклеазы.
6. Рекомбинация фрагментов ДНК. Механизм рекомбинации днк. Рекомбинантная днк.
7. Векторы. Внедрение фрагментов ДНК в клетку хозяина с помощью векторов.
8. Плазмиды. Бактериофаги. Космида. Бактериальные искусственные хромосомы. Искусственные дрожжевые хромосомы.
9. Выявление клеток-хозяев на рекомбинантный вектор. Скрининг клеток-хозяев на рекомбинантный вектор. Саузерн-блоттинг.
10. Геномные библиотеки. Создание геномных библиотек. Типы геномных библиотек.

Выявление клеток-хозяев на рекомбинантный вектор. Скрининг клеток-хозяев на рекомбинантный вектор. Саузерн-блоттинг.

После того как трансформированные бактериальные клетки размножатся в культуральной среде, их рассевают на питательный агар в чашки Петри.

Обычно, чтобы облегчить скрининг трансформированных бактерий, чужеродная ДНК встраивается в вектор таким образом, что она разрушает ген устойчивости к какому-либо антибиотику.

В результате трансформированная клетка оказывается чувствительной к этому антибиотику и ее можно выявить на селективном агаре с добавлением соответствующего антибиотика.

Для этого с исходной чашки Петри с выросшими на ней колониями делают реплики методом отпечатков. Колонии, выросшие на репликах, сравнивают с колониями на исходной чашке Петри и выявляют колонии, возникшие из трансформированной бактериальной клетки.

Клонированную чужеродную ДНК можно теперь обнаружить с помощью ее гибридизации с радиоактивно меченной пробой или зондом ДНК.

Выявление клеток-хозяев на рекомбинантный вектор
Рис. 7.3. Метод Саузерн-блоттинга для идентификации определенного фрагмента ДНК, или гена.

Зонды ДНК или РНК представляют собой однонитевые последовательности, меченные либо радиоактивным фосфором, либо нуклеотидами, меченными флюоресцентными красителями. Они могут быть получены из разных источников.

В зависимости от цели, преследуемой исследователем, это могут быть последовательности генов, мРНК, кДНК, олигонуклеотидные последовательности, синтезированные химическим путем и представляющие собой нуклеотидные последовательности, кодирующие часть какого-то белка и т.д.

Для того чтобы с помощью ДНК-зонда выявить, есть ли среди клонированных фрагментов ДНК комплементарные зонду последовательности, его необходимо гибридизовать с этими фрагментами, которые предварительно должны быть денатурированы, т.е. превращены в однонитевые структуры или щелочью, или нагреванием.

Такая процедура гибридизации зонда ДНК, конечно, может быть осуществлена не только с клонированными, но и любыми другими последовательностями ДНК, полученными, например, после рестрикции геномной ДНК и т.д.

Гибридизацию зонда ДНК с фрагментами ДНК, полученными после клонирования или рестрикции или того и другого, производят после их электрофореза в агарозном геле, где они распределяются в соответствии с размерами (чем короче фрагмент, тем быстрее он движется в геле), денатурации и перенесения на нитроцеллю-лозный или нейлоновый фильтр, с которым однонитевые последовательности ДНК прочно связываются.

Метод перенесения однонитевых фрагментов ДНК на фильтр и их связывания с фильтром получил название по имени его создателя Саузерн-блоттинга. Если на приготовленный таким образом фильтр наносят меченный тем или иным способом зонд ДНК, то при наличии на фильтре искомого фрагмента ДНК происходит его гибридизация с зондом, что можно выявить с помощью радиоавтографии либо люминесцентного окрашивания (рис. 7.3).

Если искомым фрагментом является мРНК, то процедуру ее связывания с фильтром называют Нозерн-блоттингом. Нозерн-блоттинг используется нередко для выявления временных и тканевых особенностей проявления генов.

- Читать далее "Геномные библиотеки. Создание геномных библиотек. Типы геномных библиотек."