Одна из таких манипуляций, может быть, самая важная в программе «Геном человека», заключается в секвенировании фрагментов ДНК, т.е. определении последовательности нук-леотидов во фрагменте. Именно эта процедура позволяет, в частности, расшифровать структуру гена, установить природу мутаций в нем, определить аминокислотную последовательность в молекуле белка, кодируемого этим геном, и т.д.

Наиболее распространенным методом, который используют для секвенирования ДНК, является метод, разработанный Фредериком Сэнгером. Этот метод называется еще дидезокси-методом, поскольку в нем применяют дидезоксинуклеотиды для терминации синтеза цепи ДНК. Дидезоксинуклеотиды похожи на обычные нуклеотиды, но в них отсутствует З'-гид-роксильная группа, и это препятствует образованию фосфодиэфирной связи со свободным нуклеотидом.

В результате дидезоксинуклеотид, присоединившись к растущей цепи ДНК, этот синтез прекращает.

Чтобы осуществить сиквенс фрагмента ДНК, его сначала разделяют на две нити. Эти нити смешивают с радиоактивно меченным коротким праймером, смесью из 4 обычных нук-леотидов, ДНК-полимеразой и с одним из 4 дидезоксинукле-отидов (А,Т,Г,Ц), поэтому одновременно реакция синтеза с одним фрагментом ДНК идет в 4 пробирках, которые отличаются только по содержанию в ней определенного дидезоксинуклеотида. Репликация начинается с синтезированного отрезка ДНК, комплементарного праймеру, который присоединяется к комплементарной последовательности нити ДНК, и ДНК-полимераза, начиная от праймера, достраивает комплементарную цепь.

Как только к этой цепи присоединяется дидезоксинуклеотид, ее синтез прекращается. Поскольку присоединение дидезоксинуклеотида происходит случайно, так как в реакционной смеси есть его нормальный аналог, то в каждой пробирке образуется набор цепей разной длины. Однако каждая цепь заканчивается соответствующим дидезок-синуклеотидом, который, напомним, разный в разных пробирках. В результате осуществляется мечение всех позиций в цепи, где находится каждый из 4 нуклеотидов. Чтобы эту метку выявить, достаточно с помощью электрофореза распределить цепи, образованные в каждой пробирке, по длине. Для этого проводят электрофорез продуктов синтеза цепей ДНК в каждой пробирке на одной пластинке рядом друг с другом, чтобы можно было сравнить положение каждого фрагмента по отношению к другим фрагментам.

Так как каждая полоска на электрофореграмме будет соответствовать цепи ДНК, заканчивающейся одним из 4 нуклеотидов, то последовательность нуклеотидов в цепи может быть легко прочитана по тому порядку полос на геле (снизу вверх), который выявляется после радиоавтографии (радиоавтография обеспечивается тем, что в каждой синтезированной цепи ДНК есть радиоактивно меченный праймер) (рис. 7.5).

Реализация программы «Геном человека» потребовала разработки более быстрых методов сиквенса ДНК. Были разработаны на основе только что изложенного принципа методы автоматического сиквенса, в которых используют мечение либо праймеров, либо дидезоксинуклеотидов флюоресцентной или хемилюминесцентной меткой, выявляемой специальной лазерной системой обнаружения метки во время электрофореза.

Сигналы из лазерной системы детекции поступают в компьютер, где на основе специальной программы они интерпретируются в терминах нуклеотидов, обозначаемых пиками разного цвета на мониторе компьютера. Автоматические секвенаторы позволяют ускорить получение результатов сиквенса в десятки или даже в сотни раз по сравнению с ручным сиквенсом. К июню 2000 г. группы, осуществлявшие сиквенс генома человека, проводили его со скоростью, эквивалентной однократному покрытию генома в течение 6 нед.

- Читать далее "Геном человека. Создание генетической карты генома человека."