Советуем для ознакомления:

Разделы генетики:

Популярные разделы сайта:

Оглавление темы "Генетическая карта. Генетический полиморфизм.":
1. Генетическая карта. Генетическое картирование.
2. Сцепление генов. Анализ сцепления генов.
3. Генетический полиморфизм. Генетический полиморфный признак.
4. Сайт рестрикции. Рестриктаза. VNTR-полиморфизм.
5. Микросателлитные повторы. Однонуклеотидный полиморфизм.

Сайт рестрикции. Рестриктаза. VNTR-полиморфизм.

Одним из первых был обнаружен полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ). О том, что такое ферменты рестрикции (рестриктазы) и как они действуют, описывалось в главе 7. Каждая рестриктаза разрезает молекулу ДНК, распознавая специфическую для нее последовательность нуклеотидов, которую называют сайтом рестрикции.

Если в сайте рестрикции независимо от того, где он находится, возникает мутация и изменяется последовательность нуклеотидов, то рестриктаза не узнает такой измененный сайт и не разрезает в этом месте молекулу ДНК. В то же время рестриктаза продолжает разрезать соседние неизмененные сайты рестрикции.

В результате в мутантной ДНК один из фрагментов рестрикции оказывается длиннее, чем соответствующие фрагменты в немутантной ДНК. Для того чтобы выявить наличие полиморфного по рестрикции сайта в ДНК, после обработки рестриктазой ее подвергают электрофорезу.

Во время электрофореза фрагменты ДНК распределяются в соответствии со своей молекулярной массой. Обычно после рестрикции геномной ДНК образуются сотни тысяч фрагментов. Эти фрагменты денатурируются, т.е. превращаются в од-нонитевые, их переносят на нитроцеллюлезный фильтр, с которым они прочно связываются. Напомним, что эта процедура называется блоттингом по Саузерну.

Сайт рестрикции. Рестриктаза. VNTR-полиморфизм

Поскольку некоторые рестриктазы разрезают ДНК достаточно часто, поиск полиморфизма можно вести с помощью различных ДНК-зондов, предварительно меченных радиоактивным фосфором. Это могут быть зонды к участкам генов или любым другим последовательностям ДНК, локализация которых известна.

Зонды соединяются с комплементарными последовательностями ДНК, и меченые фрагменты можно выявить с помощью авторадиографии. В тех случаях, когда определенный зонд выявляет у разных людей разное количество меченых фрагментов или фрагментов с разной молекулярной массой, можно предполагать наличие рестрикционного полиморфизма в определенном локусе ДНК.

Таким образом, можно обнаруживать мутации в генах, если эти мутации меняют сайт рестрикции для определенных рестриктаз. В настоящее время известно сотни рестриктаз, которые распознают разные последовательности нуклеотидов. В распоряжении исследователей имеются тысячи ДНК-зондов к разным участкам генома.

Использование этих возможностей привело к выявлению многих тысяч полиморфных сайтов в человеческом геноме. В абсолютном большинстве случаев ПДРФ представляет собой двухаллельную систему (наличие или отсутствие сайта рестрикции), тем не менее высокая частота таких полиморфизмов была успешно использована при картировании многих генов наследственных болезней, в том числе муковисци-доза, нейрофиброматоза 1-го типа и многих других.

Значительно большее количество аллелей, а следовательно, и большее генетическое разнообразие, а также информационная ценность у еще одного типа ДНК-полиморфизма, который называют варьирующим числом тандемных повторов, или VNTR-полиморфизмом.

Описывая различные типы ДНК, которые встречаются в геноме человека, мы упоминали минисателлитные повторы. Эти повторы разбросаны по геному, их основная последовательность может включать до 80 нуклеотидов, а число повторов основной последовательности может варьировать в широких пределах.

Выявление VNTR-полиморфизма начинается, так же как и выявление ПДРФ, с разрезания геномной ДНК той или иной рестриктазой, электрофореза фрагментов, их денатурации и блоттинга по Саузерну. Отличие заключается в том, что для гибридизации используют ДНК-зонды, специфичные для определенного минисателлитного повтора.

- Читать далее "Микросателлитные повторы. Однонуклеотидный полиморфизм."