Для подтверждения участия фосфатных групп в процессе регуляции рецепторов было изучено влияние модификации препарата мембран головного мозга крыс молибдатом аммония на связывание 3H-D-Ala2, энкефалина с 6-рецептором. Проведенное исследование показало, что уровень связывания 3H-D-Ala2, энкефалина с модифицированным (NH4)Mo04 рецептором (кривая 1) в 3 раза выше контрольного, связывание 3H-D-Ala2,энкефалина с u-рецептором при этом не меняется. Добавление ионов Са2+ в среду инкубации значительно увеличивает уровень связывания 3H-D-Ala2, энкефалина с высокоаффинным рецептором в контрольном препарате, но не в препарате, преинкубированном с (NH4)2Mo04.

И наконец, уровни связывания 3H~D-Ala2, энкефалина с контрольным препаратом в присутствии высоких концентраций Са2+ близки к уровню связывания лиганда с модифицированным препаратом. Таким образом, результаты по химической модификации высокоаффинных центров связывания D-Ala2, энкефалина молибдатом аммония подтверждают предположение об у 1астии остатков R-0-PО42-в связывании ионов металлов. Применение разработанного нами корреляционного подхода для выявления природы исследуемых катионсвязывающих участков u-рецепторов показывает, что близкие к единице значения коэффициентов корреляции наблюдаются в случае имидазола и гистидина. Выше было отмечено, что ионы Са2+ хотя и не активируют, как большинство остальных изученных ионов, u-рецепторы, но также взаимодействуют с их катионсвязывающими участками.

Данное предположение подтверждается результатами исследования корреляционных зависимостей. Итак, полученные результаты позволяют предположить, что катионсвязывающий участок u-рецептора содержит имидазольную группу. Этому предположению соответствует и определенное выше значение рКа катионсвязывающего участка u-рецептора (рК), равное 6,4.

На возможное участие остатка гистидина в структуре рецептора указывают результаты химической модификации мембранного препарата диэтилпирокарбонатом (ЛЭПК) (Зайцев, Породенко, Варфоломеев, 1985; Зайцев, 1987).

Этот реагент при концентрациях ионов водорода, близких к нейтральным, обладает высокой селективностью к имидазольным группам гистидина.

Результаты изучения химической модификации опиоидных рецепторов ДЭПК позволяют сделать следующие выводы. Во-первых, исследование кинетики инактивации опиоидных рецепторов в процессе преинкубации препаратов мембран с ДЭПК) показывает, что модификатор ингибирует связывание 3H-D-Ala2, энкефалина с u-рецептором, практически не оказывая влияния за изученное время (до 5 мин) на комплексообразование лиганда с рецептором. Во-вторых, присутствие в процессе модификации опиатных лигандов защищает рецептор от модификации. При этом концентрации, уменьшающие инактивацию на 50%, равны 3, 7 и 200 нМ для налоксона, морфина и D-Ala2, энкефалина соответственно.

Эти значения близки константам диссоциации комплексов лигандов с рецептором. В-третьих, селективные активаторы комплексообразования D-Ala2, энкефалина с u-рецептором - ионы Ni2+ - защищают рецептор от инактивации ДЭПК. Преинкубация препаратов мембран с 1,2 мМ ДЭПК в течение 3 мин приводит к снижению уровня связывания 3H-D-Ala2, энкефалина с uрецептором на 85%. При добавлении до обработки ДЭПК 1 мМ NiCb уровень связывания 3H-D-Ala2, энкефалина составляет 91%. Как показала проверка, эффект ионов Ni2+ не связан с комплексообразованием иона Ni2+ с ДЭПК. Отсюда следует, что модифицируемая группа входит в состав катионсвязывающего участка низкоаффинного центра связывания D-Ala2, энкефалина. Эффект ДЭПК на этот центр обращается гидроксиламином.

Все это говорит о том, что наблюдаемое нами ингибирующее влияние ДЭПК на связывание D-Ala, энкефалина с u-рецептором обусловлено модификацией этим, реагентом имидазола гистидина.

Итак, низкоаффинный центр связывания 3H-D-Ala2, D-Leu5-энкефалина (высокоаффинный центр связывания морфина) содержит остаток гистидина, и свойства этого центра, в частности сродство к D-Ala, энкефалину и морфину, зависят от присутствия в среде ионов Mg2+ и переходных металлов.

- Читать далее "Радиорецепторный анализ. Техника радиорецепторного анализа"