Изменчивость вируса ВИЧ и его гетерогенность
Различия последовательностей нуклеотидов в геномной РНК различных изолятов ВИЧ (т.е. генетические различия) вирусов имеют следствием и серологические различия, и различия биологических свойств. Происхождение различных штаммов ВИЧ не известно.
Однако подробные исследования механизмов работы вирусной обратной транскриптазы показали, что этот фермент «запрограммирован» на внесение генетических ошибок при транскрипции ДНК, что и приводит к появлению изменений в геноме дочерних вирионов по сравнению с исходным вариантом.
Было показано, что точность работы этого фермента при работе с матрицей РНК в несколько раз выше, чем при работе с матрицей ДНК, то есть большинство мутаций, по-видимому, происходят на ДНК-матрице с ДНК праймером. По оценкам исследователей, в течение одного цикла репликации происходит до 10 замен оснований в геноме.
Методы молекулярной биологии помогли идентифицировать геномные вариации, обусловливающие гетерогенность ретровирусов.
Рисунок составлен на основании данных анализа нескольких ранних изолятов ВИЧ-1.
Чувствительность генома ВИЧ к рестрикционным ферментам как причина изменчивости
Одним из первых различий, обнаруженных между изолятами ВИЧ-1, были различия клонированной провируснои ДНК в чувствительности к действию рестрикционных ферментов. При тестировании рестрикционных ферментов на двух прототипных вариантах, HTLV-III и LAV, они действовали практически одинаково, однако у третьего, ARV-2 (HIV-1 ), обнаружили существенные отличия.
Эти различия в последовательностях, образующихся при действии рестрикционных ферменов, стали критерием при сравнительной идентификации различных изолятов.
У вирусов, выделенных от одного пациента, сохраняются определенные сайты для действия ферментов рестрикции, и таким образом можно идентифицировать вирусы, полученные от одного пациента. Аналогично изоляты ВИЧ-1 от матери и ребенка, а также людей, которым была перелита кровь или факторы свертывания от одного донора, или половых партнеров демонстрируют близкое сходство сайтов для расщепления рестрикционными ферментами.
Другим методом, который используют для определения квазивидовых различий между ВИЧ-1, является гибридизационный анализ ДНК в агарозном геле, который позволяет определить различные области генома. Этот быстрый метод используют для изучения геномных различий между изолятами ВИЧ и эволюции разновидностей генома с течением времени.
Т-клетки линии HUT 78 были подвергнуты острому заражению ВИЧ-1SF2 (ранее ARV-2) (дорожка 1), SF-4 (дорожка 3) и SF-19 (дорожка 4).
На дорожку 2 был нанесен образец клеток линии HUT 78, хронически инфицированных ВИЧ-1SF2.
Высокомолекулярная ДНК была выделена из целых клеток и обработана рестрикционными ферментами, а затем подвернута блоттингу, процедура которого описана ранее.
На панели А представлена нерасщепленная высокомолекулярная ДНК клетки. Показаны положения нерасщепленных форм ДНК ВИЧ-1.
IN - интегрированная в геном; NC (nicked circles) - однонитевые кольцевые; L - линейная (9,7 кб); S - сверхспиралирализованная.
Интегрированная в геном вирусная ДНК в нерасщепленных образцах ДНК находится на пределе пропускающей способности агарозного геля (свыше 20 кДа).
Различия в генетических последовательностях у ВИЧ
После получения данных о полной генетической последовательности для ряда первичных изолятов ВИЧ-1 стало очевидно, что HTLV-IIIB и LAV представляют собой один и тот же изолят (ВИЧ-1LAI), тогда как ARV-2 (SF2) и впоследствии другие изоляты ВИЧ-1 отличались от HTLV-IIIB/LAV по последовательностям нуклеотидов в геномах. По крайней мере от 6 до 10% вирусного генома может различаться между изолятами, полученными от различных больных.
Некоторые вирусы значительно различаются по синономичным изменениям последовательности нуклеотидов (т. е. мутациям, которые не влияют на последовательность аминокислот в кодируемых белках) и несинонимичным изменениям последовательности (мутациям, влияющим на аминоксилотную последовательность).
Наибольшую несинонимичную гетерогенность последовательностей нуклеотидов наблюдают в генах, кодирующих регуляторные белки и белки оболочки. В некоторых изолятах обнаруживают до 40% различий в аминокислотных последовательностях у ряда вирусных белков.
Область Env V3-V5 была амплифицированна с помощью ПЦР из продольно расположенных МКПК, собранных после сероконверсии (промаркированных в соответствии с годом, с началом 0) и из двух культур, амплифицированных in vitro (промаркированных С, с номером соответствующего года).
В нулевой момент времени продукт ПЦР был помечен радиоактивной меткой и подвергнут новому отжигу для получения избытка ДНК из этого и других образцов.
Меченные гибридные ДНК были разделены с помощью неденатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле и подвергнуты авторадиографии.
Анализ показал, что с течением времени происходит очищение самого раннего нулевого варианта, которое отражается в исчезновении наиболее подвижных гомодуплексов меченой ДНК, увеличения генетических различий, выявляемых в виде большого числа гетеродуплексных полос ДНК и появления малоподвижных меченых гетеродуплексов.
В изолятах из культуры генетические различия были выражены меньше, чем в образцах, полученных из некультивированных мононуклеарных клеток периферической крови.
- Читать "Группы и субтипы ВИЧ-1 - изменчивость"
Оглавление темы "ВИЧ":