Ранее в отдельных статьях мы обсуждали этапы развития продуктивной вирусной инфекции и ее последствия. Другой важный вопрос касается событий, происходящих при заражении ВИЧ «покоящегося» лимфоцита. Первые эксперименты с ВИЧ-инфицированием лимфоцитов показали, что репликация вируса лучше всего происходит при антиген- или митоген-индуцированной активации. Если затормозить пролиферацию клеток перевивной линии с помощью фармакологических препаратов, то в некоторых клетках репликация ВИЧ прекращается, а в других не изменяется.

Однако эти системы не отражают ситуации, которая складывается в нормальных условиях в периферических CD4+-лимфоцитах периферической крови. В некоторых исследованиях было показано, что активированные CD4+-клетки, инфицированные ВИЧ, могут переходить обратно в неактивированное состояние, на что указывают известные поверхностные маркеры клетки (например, CD69 CD25 Ki67 ).

Такие наблюдения в культурах клеток заслуживают дальнейшего изучения с целью использования в качестве модели для исследования латентного состояния ВИЧ в нативных CD4+-лимфоцитах.

1. CD4-клетки периферической крови и ВИЧ in vito

Ранние исследования с использованием неделящихся CD4+-T-клеток периферической крови позволили получить ценные сведения относительно процессов, участвующих в эффективной вирусной инфекции и продукции вирусного потомства. Результаты показали, что степень активации клетки (судя по экспрессии HLA-DR и CD25) может влиять на интенсивность обратной транскрипции с вирусного генома и на высвобождение новых вирионов из клетки.

CD4+-клетки с полностью заблокированным синтезом ДНК, находящиеся в неактивированном состоянии (в стадии G0/G1) (т.е. не экспрессирующие HLA-DR и экспрессирующие мало CD25), не подвергаются продуктивному ВИЧ-инфицированию. Несмотря на экспрессию CD4, в этих клетках не проявляются признаки вирусной инфекции и при их активации в условиях, достаточных для поддержания эффективной продукции вируса в культурах клеток in vitro.

Молекулярные исследования показали, что вирус проникает в покоющуюся клетку, но затем обычно образуются только короткие транскрипты вирусной ДНК; обратная транскрипция осуществляется медленно или не полностью и не может активироваться после проникновения вируса. Преинтеграционные комплексы находятся в лабильном состоянии. Таким образом, инфекция носит абортивный характер, и процессы катаболизма в клетке снижают репликативную способность инфекционного вируса в течение от 1 до 2 дней.

Некоторые исследователи показали, что покоящиеся CD4+-лимфоциты могут инфицироваться in vitro, при этом репликация вируса сначала подавлена, но может быть активирована. Определение «покоящиеся» имеет важное значение, поскольку эти клетки могли ранее находится в активном состоянии и в них могут сохраняться внутриклеточные факторы, экспрессия которых необходима для развития ВИЧ-инфекции. Неинтегрированные формы провирусной ДНК можно определить с помощью ПЦР в таких покоящихся Т-клетках в период от нескольких дней до двух недель после экспозиции с вирусом.

После активации эти клетки начинают выделять инфекционно дееспособные дочерние вирусы. Данные исследования позволили предположить, что вирус проникает в «покоящуюся» клетку, но транскрипция вирусных генов носит ограниченный характер. Провирусная ДНК не интегрируется в геном клетки-хозяина, и вирусные белки не вырабатываются. В определенных случаях, если эти клетки не активируются в течение трех-пяти дней, может произойти купирование инфекции. В других ситуациях в клетке могут производиться длинные формы провирусной ДНК, инфекция принимает непродуктивный характер и способна персистировать от двух до четырех недель. При таком типе инфицирования преинтеграционные комплексы остаются в цитоплазме до тех пор, пока активация не приведет к быстрой транспортировке PIC в ядро, процесс которой требует АТФ и не требует деления клетки. После активации образуется полноразмерная провирусная ДНК, которая эффективно интегрируется в хромосомы, после чего начинается продукция новых вирусных частиц.

Сравнение состояний покоя и активации клетки в отношении поддержания вирусной инфекции представляет существенный интерес. Покоящиеся клетки, не экспрессирующие CD25, проявляют невосприимчивость к ВИЧ-инфекции, наиболее вероятно на стадии проникновения вируса в клетку, поскольку в клетках не удается обнаружить никаких следов вирусных транскриптов. Однако при совместном культивировании с CD257 CD4+-клетками все-таки происходит непродуктивное инфицирование покоящихся CD25 -клеток, сходное с описанным выше.

Некоторые факторы, вырабатываемые CD25+-клетками (например, IL-2) могут оказывать влияние на этот процесс, увеличивая чувствительность клеток-мишеней к инфекции.

Другие эксперименты показывают, что ВИЧ способен проникать в выделенные CD45RA+ (покоящиеся лимфоциты) или CD45RO+ (лимфоциты памяти) CD4+-клетки, но только в CD45RCT CD4-клетках (лимфоцитах памяти) со временем наблюдается продуцирование вируса. Эти исследования позволили предположить, что вирус проникает в неиммунные CD45RA+ клетки, но до тех пор, пока на клетку не подействуют стимулы, вызывающие ее активацию, инфекция протекает в абортивной форме, что, скорее всего, связано с подавлением транспортировки преинтеграционных комплексов вируса в ядро. Эти результаты не согласуются с данными, которые показывают, что экспрессия хемокиновых рецепторов на неиммунных (CXCR4) клетках, в отличие от клеток памяти (CCR5+) может влиять на вирусную инфекцию.

В упомянутых исследованиях оба типа клеток экспрессировали CXCR4 и проявляли чувствительность к вирусу биотипа Х4. Однако состояние активации определяет степень репликации ВИЧ, как было показано в других работах, описанных выше. Эти данные подтверждают и помогают объяснить результаты предыдущих исследований, которые говорят о предпочтительном инфицировании ВИЧ-1 CD4+-клеток памяти.

В других экспериментах, проведенных на покоящихся CD4-клетках, было показано, что ВИЧ-инфицирование макрофагов приводит к высвобождению факторов, которые взаимодействуют с В-клетками, вызывая секрецию IL-6, что делает покоящиеся CD4+-клетки пригодными для поддержания репликации вируса. Эти данные требуют дальнейшего подтверждения, но на их основании уже можно предположить возможные механизмы инфицирования покоящихся клеток; такие клетки способны играть роль длительно существующих резервуаров ВИЧ в организме.

2. Покоящиеся CD4-клетки и ВИЧ in vivo

Данные, полученные in vitro при изучении очищенных покоящихся CD4+-клеток, также были проверены в клинических исследованиях. Очищенные CD4+-клетки, полученные от людей на бессимптомной стадии инфекции, в основном состояли из покоящихся клеток, содержащих преимущественно неинтегрированную провирусную ДНК. На большинстве этих клеток не обнаруживали экспрессию HLA-DR, но на небольшом проценте клеток (0,3%) молекулы HLA-DR экспрессированы. Фенотипический анализ латентно инфицированных клеток показал практически полное отсутствие признаков вирусной инфекции.

Таким образом, такие клетки плохо распознаются иммунной системой. Если пациент получает высокоактивную противоретровирусную терапию, количество латентно инфицированных CD4+-клеток может уменьшаться до 1 миллиона на 10 миллионов клеток; после прекращения лечения реплицирующийся вирус будет обнаруживаться лишь в небольшой доле клеток. Такие латентно инфицированные клетки появляются на ранних стадиях острой ВИЧ-инфекции даже при проведении лечения.

Данные, полученные при изучении покоящихся клеток, говорят в пользу того, что у большинства пациентов на бессимптомной стадии заболевания ВИЧ присутствует в неинтегрированной неинфекционной форме после проникновения в клетку, возможно, в течение гораздо более длительного времени, чем было показано в исследованиях на культуре клеток in vitro. Другие клетки крови? также могут содержать интегрированную, но не экспрессирующуюся вирусную мРНК или даже вирусные белки. Возможно, подавление вирусной репликации в покоящихся клетках in vivo связано с действием CD8+-клеток, вырабатывающих анти-ВИЧ фактор, подавляющий репликацию вируса, и, возможно, что этот механизм вносит существенный вклад в «арест» репликации вируса в неактивированных клетках in vivo. Предположительно свободные вирионы в плазме крови являются источником повторных заражений покоящихся клеток, которые элиминируют вирусные нуклеиновые кислоты до тех пор, пока не будут чем-либо активированы.

Если репликации вируса не происходит, степень экспрессии CD4 на клетках может сохраняться на прежнем уровне, в связи с чем возможно повторное инфицирование или суперинфицирование. Таким образом, циклические флуктуации вирусной инфекции могут характеризовать динамическое состояние, наблюдающееся в организме инфицированного человека. В таких условиях существует вероятность рекомбинации разных вариантов вирусов при множественном инфицировании клетки.

3. Внутриклеточный механизм инфицирования CD4-клеток ВИЧ

Были идентифицированы внутриклеточные факторы, которые могут влиять на степень продукции вируса в покоящихся CD4+-клетках. Ими оказались белки клетки, которые связываются с ДНК (например, NF-kB) и/или РНК, которые могут тормозить репликацию ВИЧ.

Фактор транскрипции NF-kB, как правило, рассматривают в качестве существенного участника про-воспалительных процессов, в результате которых более ожидаемым является усиление репликации вирусов. Вероятно, такие параметры не подлежат однозначному толкованию.

Кроме того, как отмечали выше, результаты, полученные с R5- и Х4-изолятами ВИЧ-1, говорят о блокировке обратной транскрипции в активированных Т-клеточных линиях и макрофагах соответственно, что говорит о возможном участии сходных внутриклеточных механизмов.

Некоторые наблюдения, сделанные in vitro и in vivo, касающиеся ограничения обратной транскрипции ВИЧ в покоящихся клетках, могут объясняться по-другому. Например, в вирионах ВИЧ иногда можно обнаружить различные фрагменты молекул провирусной ДНК, что указывает на существование явления неполноценной обратной транскрипции. Наличие такой ДНК может быть причиной получения положительных результатов ПЦР-анализа, которые указывают на низкую концентрацию провирусной ДНК в покоящихся клетках. Фрагменты ДНК, полученные в результате неполноценной обратной транскрипции в клетках, могут входить в состав вирусов, связанных с клеткой, но не интернализованных, или вирусов с незавершенным циклом репликации. Однако такая возможность представляется маловероятной, поскольку в контрольных культурах, использованных для экспериментов, было обнаружено инфицирование покоящихся клеток.

Совсем недавно была показана связь торможения вирусной репликации в покоящихся CD4+-клетках с высоким уровнем экспрессии определенной разновидности APOBEC3G, а именно в покоящихся клетках обнаруживают высокое содержание низкомолекулярной формы APOBEC3G, которая тормозит репликацию вируса за счет неизвестного механизма. После активации клетки низкомолекулярная форма APOBEC3G превращается в высокомолекулярный комплекс, в форме которого APOBEC3G функционирует в нормальных условиях.

Резюме об инфицировании покоящихся CD4-клеток ВИЧ

Трудности, возникающие при объяснении данных, полученных на покоящихся клетках, связаны в первую очередь с определением «состояния покоя». Большинство иммунологов настаивает на том, что у таких клеток должна отсутствовать экспрессия CD25. Другие также подчеркивают значение отсутствия экспрессии CD69, Ki67 и HLA-DR. Если в популяции клеток in vitro присутствует небольшое количество HLA-DR+-клеток, они могут подвергаться ВИЧ-инфицированию, что может приводить к ошибочному предположению, на основании данных ПЦР-анализа, об успешном инфицировании всех клеток. Такую возможность можно исключить путем удаления всех HLA-DR+-клеток. Эти данные говорят в поддержку вывода о том, что проникновение и экспрессия вируса зависят от состояния активации клетки. Продолжительность периода времени, в течение которого клетка может нести неинтегрированную вирусную ДНК, также может коррелировать со степенью активации клетки.

Также неизвестно, каким образом покоящиеся CD4+-клетки, в которых отсутствует экспрессия HLA-DR, инфицируются in vivo. Необходимо выяснить, способны ли HLA-DR+-CD4-лимфоциты после инфицирования возвращаться в непродуктивное HLA-DR- состояние покоя. Некоторые исследования свидетельствуют о том, что такой переход возможен, но, по всей видимости, происходит крайне редко. Предположительно инфицирование может происходить при действии определенных цитокинов на покоящиеся CD4+-клетки. С другой стороны, как отмечали выше, небольшое количество покоящихся CD4+-клеток с признаками инфекции in vivo могут представлять собой небольшое количество HLA-DRf клеток, находящихся в покоящейся клеточной популяции (0,3%). Наконец необходимо выяснить клиническую значимость результатов исследований, проведенных на покоящихся Т-клетках.

Большинство CD4+-клеток in vivo находятся в состоянии относительного покоя, но при этом восприимчивы к ВИЧ и способны поддерживать продуктивную вирусную инфекцию. В связи с этим большое значение имеют факторы и события, вызывающие активацию клеток, в результате чего создаются условия, закрепляющие и интенсифицирующие вирусную инфекцию.

- Читать "Инфицирование ВИЧ покоящихся CD4-эпителиальных клеток"

1. Инфицирование ВИЧ покоящихся CD4-лимфоцитов
2. Инфицирование ВИЧ покоящихся CD4-эпителиальных клеток
3. Клеточная латентность ВИЧ-инфекции и ее активация
4. Механизмы развития латентной ВИЧ-инфекции
5. Клинически латентное состояние ВИЧ
6. Основные моменты теории репликации ВИЧ в клетках
7. Цитопатогенные свойства ВИЧ
8. Слияние клеток под действием ВИЧ - образование синцития
9. Механизм слияния клеток в синцитий при ВИЧ
10. Накопление вирусной ДНК ВИЧ как причина смерти клетки