Советуем для ознакомления:

Физиология:

Популярные разделы сайта:

Высаливание иммуноглобулинов и антител. Осаждение спиртом и электрофорез антител

Высаливание. Иммуноглобулины и прежде всего IgG характеризуются наименьшей степенью гидратации среди белков сыворотки. Поэтому они прежде других белков выпадают в осадок при прибавлении к сыворотке солей, энергично связывающих воду и в силу этого разрушающих гидратную оболочку белковой молекулы. Так, при концентрации сульфата аммония 34—35% насыщения из сыворотки выпадает IgG, не содержащий практически примеси других белков. Наибольшей полноты осаждения можно достичь при значении рН 7,0—7,2, т. е. близком к изоэлектрической точке наименее заряженных молекул IgG. Осажденные сульфатом аммония иммуноглобулины обычно полностью растворяются после удаления соли диализом. Простота метода и возможность с его помощью значительно увеличить удельную концентрацию иммуноглобулинов в растворе делает его одним из наиболее популярных методов выделения иммуноглобулинов.

Для высаливания иммуноглобулинов используют также сульфат натрия. IgG осаждают при концентрации соли, равной 18%. После повторного осаждения белка в тех же условиях удается получить препараты, содержащие лишь незначительные примеси других сывороточных белков.
При нейтральных значениях рН IgG осаждается 0,1 М раствором сульфата цинка. Так как при этом не происходит осаждения IgA, метод нашел применение для выделения из сыворотки человека иммуноглобулинов класса А.

Осаждение спиртом. Фракционирование сывороточных белков спиртом широко используют в производстве различных сывороточных препаратов, в том числе коммерческих препаратов гамма-глобулина человека из донорской и плацентарной крови. В настоящее время в лабораторной практике метод практически не применяют из-за его трудоемкости.

электрофорез антител

Препаративный электрофорез. Предложены различные модификации метода, позволяющие выделять и фракционировать иммуноглобулины. Обычно применяют методы зонного электрофореза в блоках, содержащих инертный, водонерастворнмый носитель: специально обработанный крахмал, сефадекс, полиакриламид и др. В виде блока используют также различные гели, главным образом агара и агарозы. Методом препаративного электрофореза удается выделить из сыворотки иммуноглобулины различных классов, а в сочетании с ионообменной хроматограграфией и отдельные подклассы.

Ионообменная хроматография и гель-фильтрация. Эти методы получили в настоящее время наибольшее распространение. Для ионообменной хроматографии, как правило, используют диэтиламиноэтилцеллюлозу (ДЭАЭ-целлюлоза) или ДЭАЭ-сефадекс. Ионообменники уравновешивают буферными растворами низкой ионной силы (0,005—0,02 моль) при рН 7,2—8,2 с целью выделения IgG. В указанных условиях наименее заряженная часть молекул IgG не фиксируется на ионообменннке, в то время как другие иммуноглобулины и сывороточные белки связаны. Фракционирование можно проводить методом колоночной хроматографии или в объеме. С целью экономии ионообменника для очистки IgG целесообразно выделить первоначально из сыворотки общую глобулиновую фракцию осаждением сульфатом аммония при 50%-ном насыщении.

При очистке IgG с помощью ионообменной хроматографии неизбежны ощутимые потери. Во-первых, по степени растворимости в растворах низкой ионной силы IgG, как и ряд других сывороточных глобулинов, состоит из двух видов молекул: высокорастворимых, образующих фракцию псевдоглобулинов, и мало растворимых, составляющих фракцию эуглобулинов. Антитела распределены в обеих фракциях. Однако из-за особенностей техники ионообменной хроматографии (проведение процедуры с использованием растворов низкой ионной силы) фракция эуглобулинов теряется. Во-вторых, в силу значительной неоднородности IgG по электрическому заряду (изоэлектрические точки в диапазоне рН 6,6— 7,6) часть молекул связана с ионообменником даже при хроматографии в буфере рН 6,8—7,2. В результате общий выход IgG едва превышает 50%.

- Читать далее "Хроматография иммуноглобулинов и антител. Специфическая очистка антител"

Оглавление темы "Аутоиммунная патология. Исследование антител":
1. Аутоиммунные болезни. Толероген
2. Срыв толерантности иммунной системы. Аутоиммунные заболевания человека
3. Генетические факторы аутоиммунных заболеваний. Очистка иммуноглобулинов и антител
4. Высаливание иммуноглобулинов и антител. Осаждение спиртом и электрофорез антител
5. Хроматография иммуноглобулинов и антител. Специфическая очистка антител
6. Естественные иммуносорбенты. Аффинная хроматография в иммунологии
7. Использование иммуносорбента для антигена. Оценка специфичности сорбции лиганда
8. Неспецифическая сорбция. Регистрация реакции антиген (гаптен)-антитело
9. Метод равновесного диализа. Оптические методы выявления антигена-гаптена
10. Тушение флуоресценции антител. Спектрофлуорометрия и радиоспектроскопия