Советуем для ознакомления:

Физиология:

Популярные разделы сайта:

Хроматография иммуноглобулинов и антител. Специфическая очистка антител

С использованием ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе (сефадексе) можно разделить иммуноглобулины IgM и IgA, используя непрерывный (линейный) или ступенчатый градиент концентрации буферного раствора. Разделение достаточно грубое, и для получения очищенных препаратов приходится прибегать к ряду других процедур: гель-хроматографии на сефадексах G-150 или G-200, ионообменной хроматографии на карбоксиметилцеллюлозе.

Специфическая очистка антител. Антитела могут быть извлечены из смеси других белков только с помощью антигена. При этом антитело определенной специфичности может быть отделено также от других по специфичности антител с теми же физико-химическими свойствами. Процедура состоит из двух частей: получения комплекса антиген-антитело и его диссоциации с последующим разделением антигена и антитела. Рассмотрим основные методические приемы, используемые для очистки антител.

Получение комплекса антиген-антитело в нерастворимом виде. В случае низкоднсперсных антигенов: бактерий, клеток эукариот после сорбции антител достаточно промыть комплекс, чтобы приступить к элюции антител. В случае высокодисперсных антигенов, включая растворимые в воде биополимеры, комплекс получают в форме преципитата. Наиболее универсальный способ состоит в приготовлении иммобилизованных на водонерастворимом носителе антигенов или гаптенов. Носителями служат порошок целлюлозы, сефадекс, сефароза, биогель. Антигены (гаптены) фиксируют ковалентно. Предложены десятки способов фиксации антигенов на носителе, различающиеся в том числе тем, какая группировка антигена использована для его присоединения к носителю.
Приведем в качестве примера предложенный А. Гурвичем (1958) метод фиксации белковых антигенов на целлюлозе с помощью так называемого галлоидоалкилата.

иммуноглобулины

Широко в настоящее время применяется метод фиксации антигенов на сефарозе (сефадексе), активированной бромцианом.
Иммобилизованные антигены (гаптены) получили название иммуносорбентов. В случае применения иммуносорбентов для колоночной хроматографии этот способ становится одним из вариантов аффинной хроматографии, т. е. метода фракционирования, основанного на высокой, степени сродства адсорбируемого вещества к сорбенту.

Элюция антител. Диссоциацию комплекса антиген-антитело с целью элюцни антител производят либо путем специфического вытеснения их избытком простого гаптена, либо неспецифически. В последнем случае в зависимости от строения антигена, а следовательно, типа связен между антигеном и антителом применимы самые разнообразные способы. Чаше других используют буферные растворы с низкими значениями рН: 2,4—3,0. Реже применяют щелочные буферные растворы, концентрированные (8—10 М), нейтральные растворы аминов (мочевины) или растворы с достаточно высокой концентрацией хаотропных ионов: I-CNS.

Если используют иммуносорбент с ковалентно связанным антигеном, нет опасности попадания антигена в раствор антител в описанных условиях. Поэтому достаточно провести диализ элюпрованных антител против изотонического раствора хлорида натрия, чтобы завершить процедуру их выделения. То же относится и к элюцни антител с сорбента с помощью гаптена. Обычно применяют гаптен с низким сродством к антителу, чтобы с достаточной полнотой удалить его затем из элюата антител. Например, при выделении антидинитрофенильных антител используют в качестве гаптена динитрофенол, константа сродства которого на два порядка меньше, чем константа сродства к антителу динитрофениллизина.

Динитрофенол можно затем удалить на ионообменнике {например, дауэкс 1X10). В то же время достаточно полное освобождение раствора антидиннтрофенильных антител от динитрофениллизина практически невозможно, в силу чего этот высокоэффективный диссоциирующий агент не применяется для получения антидиннтрофенильных антител.

- Читать далее "Естественные иммуносорбенты. Аффинная хроматография в иммунологии"

Оглавление темы "Аутоиммунная патология. Исследование антител":
1. Аутоиммунные болезни. Толероген
2. Срыв толерантности иммунной системы. Аутоиммунные заболевания человека
3. Генетические факторы аутоиммунных заболеваний. Очистка иммуноглобулинов и антител
4. Высаливание иммуноглобулинов и антител. Осаждение спиртом и электрофорез антител
5. Хроматография иммуноглобулинов и антител. Специфическая очистка антител
6. Естественные иммуносорбенты. Аффинная хроматография в иммунологии
7. Использование иммуносорбента для антигена. Оценка специфичности сорбции лиганда
8. Неспецифическая сорбция. Регистрация реакции антиген (гаптен)-антитело
9. Метод равновесного диализа. Оптические методы выявления антигена-гаптена
10. Тушение флуоресценции антител. Спектрофлуорометрия и радиоспектроскопия