Советуем для ознакомления:

Физиология:

Популярные разделы сайта:

Естественные иммуносорбенты. Аффинная хроматография в иммунологии

При использовании в качестве естественных иммуносорбентов низкодисперсных антигенов велика опасность загрязнения антигеном элюпрованных антител даже при применении достаточно мягких способов элюцни последних. Чтобы исключить или уменьшить элюцию антигена, например, с поверхности бактериальной клетки, находящиеся на ее поверхности высокомолекулярные вещества фиксируют с помощью глутарового альдегида.

При низких значениях рН в концентрированных растворах аминов или в присутствии хаотропных агентов конформация антител изменяется. Однако эти изменения носят в основном обратимый характер. О качестве выполнения процедуры очистки можно судить по двум критериям: специфической активности антител (т. е. связывание ими антигена или гаптена) и по содержанию агрегированного материала (последнее устанавливают с помощью гель-фильтрации). Присутствие агрегатов сигнализирует или о наличии в растворе антител антигена и, следовательно, иммунных комплексов, или о денатурации антител.

Хранение антител можно осуществлять в замороженном виде или после высушивания (лиофилизация). Предварительно антитела концентрируют, так как хранение в сильно разбавленном виде неизбежно приведет к их денатурации. Оптимальная концентрация антител при хранении в замороженном виде 5 мг/мл.

иммуносорбенты

Аффинная хроматография в иммунологии

В предыдущем разделе говорилось об основном из применяющихся в иммунологии методе аффинной хроматографии — выделении антител с помощью иммобилизованного антигена (гаптена). Кратко охарактеризуем другие варианты метода, применяемые в иммунологии.

На нерастворимом носителе (сефароза, целлюлоза) могут быть иммобилизованы антитела, так что с помощью такого сорбента можно извлечь из смеси антигенов определенный антиген. Ковалентное связывание антител с носителем производят по возможности в мягких условиях, чтобы исключить их денатурацию. В связи с необходимостью фиксировать большие количества белка для приготовления иммуносорбента крайне редко используют очищенные антитела. Обычно используют выделенные из антисыворотки иммуноглобулины.

Емкость сорбентов с антителами значительно ниже, чем с антигеном, по следующим причинам: 1. Число активных центров в антителах, содержащихся в антисыворотке в наибольших количествах, а именно IgG, равно» двум; число детерминант в молекуле антигена, как правило, больше. 2. Стерический фактор при иммобилизации антител оказывает значительно большее влияние на связывание лиганда в случае иммобилизованных антител, нежели антигена.

С целью уменьшения вероятности пространственного экранирования активного центра антитела носителем желательно присоединять антитела к носителю через «гибкую ножку» (spacer). Функцию нсжкн могут выполнять бифункциональные реагенты типа биедиазобензидина, различные по длине алифатической цепи бромацетильные производные и др.

Если иммуносорбент с иммобилизованными антителами предполагают использовать прежде всего для извлечения из смеси определенного антигена (но не для получения его в чистом виде), фиксацию антител можно осуществить по типу «сэндвича». Первоначально иммобилизуют на носителе такой же антиген или антиген, перекрестно с ним реагирующий, а затем к иммуносорбенту добавляют большой избыток антител (антисыворотка). Часть активных центров антител, присоединенных к иммобилизованному антигену, окажется свободными. Именно за счет них «сэндвпч»-сорбент будет связывать определенный антиген из раствора.

- Читать далее "Использование иммуносорбента для антигена. Оценка специфичности сорбции лиганда"

Оглавление темы "Аутоиммунная патология. Исследование антител":
1. Аутоиммунные болезни. Толероген
2. Срыв толерантности иммунной системы. Аутоиммунные заболевания человека
3. Генетические факторы аутоиммунных заболеваний. Очистка иммуноглобулинов и антител
4. Высаливание иммуноглобулинов и антител. Осаждение спиртом и электрофорез антител
5. Хроматография иммуноглобулинов и антител. Специфическая очистка антител
6. Естественные иммуносорбенты. Аффинная хроматография в иммунологии
7. Использование иммуносорбента для антигена. Оценка специфичности сорбции лиганда
8. Неспецифическая сорбция. Регистрация реакции антиген (гаптен)-антитело
9. Метод равновесного диализа. Оптические методы выявления антигена-гаптена
10. Тушение флуоресценции антител. Спектрофлуорометрия и радиоспектроскопия