Советуем для ознакомления:

Физиология:

Популярные разделы сайта:

Модификации радиоиммунного анализа. Метод инактивации фага

Часто радиоиммунный анализ основан на принципе конкуренции меченого антигена с немеченым. Например, требуется установить, содержится ли в изучаемом препарате данный антиген? Существует тест-система, состоящая из такого же антигена, меченного радиоактивным подом, и антител к нему. Исследуемый препарат инкубируют первоначально с антителом, а затем добавляют меченый тест-антиген. Затем иммунный комплекс осаждают либо сульфатом аммония, либо антииммуноглобулиновой сывороткой. Если радиоактивность в опытной пробе ниже, чем в контрольной (где содержатся только компоненты тест-системы), значит в изучаемом образце содержится антиген, сходный или идентичный радиомеченому антигену тест-системы.

Тот же метод может быть построен на принципах иммуносорбции с использованием иммобилизованных антител. При этом отпадает необходимость осаждения иммунного комплекса. Методы, основанные на принципе конкуренции, нетрудно выполнить на количественной основе. Именно таким способом могут определяться различные гормоны, причем в количествах, не выявляемых ни одним из известных биохимических методов (от 1 до 100 пг вещества).

В биохимии часто возникает задача изучения скорости биосинтеза различных биологических макромолекул. Новообразованное вещество, включившее в процессе биосинтеза радиомеченые предшественники (меченные по 14С или 3Н аминокислоты, пуриновые или пиримидиновые основания, сахара), можно выявить с помощью той или иной модификации метода радиоиммуиного анализа. При этом наиболее целесообразно использовать антигола против изучаемого вещества, иммобилизованные на инертном носителе. Ряд примеров такого анализа приводился выше, в частности метод определения скорости биосинтеза Clq. Практически методом радиоиммунного анализа можно определить место биосинтеза и скорость биосинтеза любого органического соединения, против которого можно получить антитела.

радиоиммунный анализ

Метод инактивации фага

Метод разработан в лаборатории М. Села в конце 60-х годов. Этот метод является, видимо, наиболее чувствительным среди других иммунологических методов. Чисто теоретически с его помощью можно обнаружить всего несколько молекул антител или антигена. Принцип метода состоит в инактивации бактериофага, конъюгированного с определенным антигеном, при помощи антител против этого антигена. Фаг конъюгируют с антигеном (например, инсулином, ангиотензином), используя глутаровый альдегид, водорастворимые карбодиимиды или другие реагенты.

Конъюгацию проводят в мягких условиях, чтобы не инактивировать фаг. При постановке опыта конъюгированный фаг и антитело против присоединенного к нему антигена смешивают с бактериальными клетками-мишенями и заключают в тонкий слой мягкого агара. В качестве контроля используют только конъюгированный с антигеном фаг. В контроле фаг, заражая бактериальные клетки, вызывает их гибель. При этом вокруг каждой фаговой частицы образуется зона просветления в агаре — бляшка (plaque). В опыте за счет взаимодействия антител с антигеном, фиксированным на поверхности фаговой частицы, фаг утрачивает способность заражать бактериальные клетки. В силу этого число бляшек в опытной пробе меньше, чем в контрольной. В качестве примера приведем определение этим методом простагландинов.

С помощью антител против простагландина F2a и бактериофагов, конъюгированных с простагландииами, можно определить 140 пг простагландина F2a и < 104 пг простагландина E1. Принцип определения ничем не отличается от обсуждавшегося в предыдущем разделе принципа конкуренции антигенов за антитело тест-системы. Различия в чувствительности определения сравниваемых простагландинов прямо коррелируют со степенью их структурных отличий (напомним, что антитела были направлены против простагландина F2а).

Метод инактивации фага достаточно трудоемок и может быть использован только для решения определенных исследовательских задач.

- Читать "Иммуноферментный анализ. Иммунохимические методы в биохимии"

Оглавление темы "Количественное и качественное определение антител":
1. Меченные иминоксильными радикалами гаптены. Реакция антиген-антитело
2. Теория количественной преципитации. Первая иммунологическая реакция
3. Реакция преципитации в геле. Метод двойной диффузии в агаре
4. Метод радиальной иммунодиффузии. Иммуноэлектрофорез
5. Активная и пассивная гемагглютинация. Реакция связывания комплемента
6. Связывание комплемента иммунным комплексом. Радиоиммунологические методы исследования антител
7. Модификации радиоиммунного анализа. Метод инактивации фага
8. Иммуноферментный анализ. Иммунохимические методы в биохимии
9. Метод модификации гаптенами рибосомных белков. Метод иммуноэлектронной микроскопии
10. Рецепторы для гормонов. Антиидиотипические антитела