Советуем для ознакомления:

Физиология:

Популярные разделы сайта:

Иммуноферментный анализ. Иммунохимические методы в биохимии

Метод широко внедрен в лабораторную практику в последнее время. В основе метода— использование антител, меченных ферментами (чаще всего пероксидазой). Конъюгацию осуществляют глутаровым альдегидом или другим бифункциональным реагентом. Реакцию проводят в условиях, исключающих инактивацию фермента. Техника постановки реакции состоит в следующем. Антиген адсорбируют на поверхности лунок в пластинах из полистирола. Если антитела, меченные ферментом, направлены к адсорбированному антигену, они окажутся фиксированными в лунках. Затем в лунки вносят раствор субстрата (если к антителам присоединена пероксидаза, то это перекись водорода и индикатор — диаминобензидин). В результате ферментативного превращения субстрата появится цветной продукт. Степень окраски пропорциональна количеству сорбированных антител с ферментом.

Иммуноферментный метод пригоден для определения как антител, так и антигенов в исследовательских лабораториях и клинике. Он не требует дорогостоящего оборудования и во многих случаях может с успехом заменить радионммунологические методы.
Далее будут приведены несколько выразительных, примеров использования методологии современной иммунохимии для решения актуальных задач молекулярной биологии и классической биохимии.

биохимия

Выделение высокоочищенных мРНК. Сущность подхода состоит в использовании антител против соответствующего белка для извлечения полирибосом, содержаших растущую полипептидную цепь этого белка. Экспериментально доказано, что растущая цепь приобретает антигенную специфичность, характерную для этого белка, очевидно, за счет постепенного (начиная с N-конца) формирования ею третичной структуры. Извлечение полирибосом может быть осуществлено с помощью техники иммуносорбцпи при использовании иммобилизованных антител или путем преципитации комплекса антитело — растущая полипептидная цепь — полисома с помощью антииммуноглобулиновых антител (I. Schechter, 1972). Выделение мРНК из преципитата осуществляется на основе общепринятых методов.

Изучение топографии компонентов рибосом. Эта задача служит важной составной частью изучения проблемы биосинтеза белка. Один из перспективных подходов для ее решения — иммуноэлектронная микроскопия. Например, с помощью антител против определенного рибосомного белка можно специфически «сшить» соответствующие рибосомные субчастицы. Выделив затем димеры «сшитых» бивалентными IgG-антитслами субчастиц, их изучают с помощью электронной микроскопии и определяют локализацию соответствующего белка.

Описанная выше схема исследования по ряду причин недостаточно эффективна. Во-первых, таким способом нельзя решить важный вопрос о расположении в субчастице РНК, прежде всего ее концевых участков, так как получить к ним антитела при иммунизации собственна РНК невозможно. Во-вторых, достаточно трудно получить в иммунохимически чистом виде различные белки, входящие в состав рибосомы, что позволило бы иметь антитела к строго определенному белку. Обе эти трудности можно обойти в случае модификации рибосомион РНК и белков гаптенами и последующей димеризации рибосомных частиц антителами против этих гаптенов. В качестве примера подобного исследования можно привести работу, выполненную И. Шатским, М. Кожухаровой, Л. Мочаловой и А. Богдановым (1978—1982).

- Читать "Метод модификации гаптенами рибосомных белков. Метод иммуноэлектронной микроскопии"

Оглавление темы "Количественное и качественное определение антител":
1. Меченные иминоксильными радикалами гаптены. Реакция антиген-антитело
2. Теория количественной преципитации. Первая иммунологическая реакция
3. Реакция преципитации в геле. Метод двойной диффузии в агаре
4. Метод радиальной иммунодиффузии. Иммуноэлектрофорез
5. Активная и пассивная гемагглютинация. Реакция связывания комплемента
6. Связывание комплемента иммунным комплексом. Радиоиммунологические методы исследования антител
7. Модификации радиоиммунного анализа. Метод инактивации фага
8. Иммуноферментный анализ. Иммунохимические методы в биохимии
9. Метод модификации гаптенами рибосомных белков. Метод иммуноэлектронной микроскопии
10. Рецепторы для гормонов. Антиидиотипические антитела