Советуем для ознакомления:

Физиология:

Популярные разделы сайта:

Метод модификации гаптенами рибосомных белков. Метод иммуноэлектронной микроскопии

С целью локализации 3'-конца 16S РНК малой субчастицы рибосомы Е. coli его модифицировали гаптеном на основе лактозы. В состав гаптена входила алифатическая аминогруппа. После окисления цис-гликольной группы рибозы в 16S РНК образующийся диальдегид обрабатывали гаптеном: 6-N-[р-(D-лактозил)-бензпл]-6-аминогексиламин и восстанавливали образующееся основание Шиффа боргидридом. Модифицированную таким способом РНК использовали для реконструкции 30S субчастицы. Реконструированные субчастицы обрабатывали IgG-антилактозидными антителами кролика.

При градиентном центрифугировании обработанных подобным способом субчастиц появлялся «тяжелый» компонент с коэффициентом седиментации около 40S. Агрегация реконструированных субчасгиц носила строго специфический характер, т. е. была обусловлена антителами к лактознду, которые взаимодействовали с группировками гаптена, присоединенными к 3'-коицам 16S РНК. Последующий анализ агрегатов в электронном микроскопе позволил доказать наличие димеров рибосомных частиц, «сшитых» антителами, и определить место фиксации последних на субчастице.

С целью разработки метода модификации гаптенами рибосомных белков был использован белок S12. Использовали динитрофенильный гаптен, который вводили в молекулу белка по сульфгидрильным группам. Модифицированный белок использовали для реконструкции 30S субчастицы. То, что такой белок действительно вошел при реконструкции в состав субчастицы, было доказано следующими иммунохимическими методами.

рибосомные белки

1. Последовательной инкубацией модифицированных по белку S12 субчастиц с антидинитрофенильными антителами кролика и антителами против IgG кролика, меченными изотноцианатом флуоресцеина. После градиентного ультрацентрифугирования методом спектрофлуориметрии было установлено наличие флуорохрома в пике 30S субчастиц. Это доказывает включение модифицированного белка в реконструированную субчастицу и доступность гаптенной группировки для антител.

2. Обработкой с помощью меченых Fab-фрагментов антидинитрофенильных антител 30S субчастиц, которые реконструированы в присутствии белка S12, содержащего динитрофенильную группу. Радиоактивность была обнаружена в пике 30S субчастиц.

Тем самым двумя независимыми иммунохимическими методами доказано включение меченного гаптеном белка в состав реконструированной рибосомы и доступность гаптенной группировки для антител. Последнее нашло также подтверждение в факте формирования димеров субчастиц, содержащих модифицированный белок S12 в присутствии антидинитрофенильных антител.

Метод иммуноэлектронной микроскопии может быть использован для изучения топографии не только рибосомных частиц, но и самых разнообразных самособирающихся надмолекулярных структур.

- Читать "Рецепторы для гормонов. Антиидиотипические антитела"

Оглавление темы "Количественное и качественное определение антител":
1. Меченные иминоксильными радикалами гаптены. Реакция антиген-антитело
2. Теория количественной преципитации. Первая иммунологическая реакция
3. Реакция преципитации в геле. Метод двойной диффузии в агаре
4. Метод радиальной иммунодиффузии. Иммуноэлектрофорез
5. Активная и пассивная гемагглютинация. Реакция связывания комплемента
6. Связывание комплемента иммунным комплексом. Радиоиммунологические методы исследования антител
7. Модификации радиоиммунного анализа. Метод инактивации фага
8. Иммуноферментный анализ. Иммунохимические методы в биохимии
9. Метод модификации гаптенами рибосомных белков. Метод иммуноэлектронной микроскопии
10. Рецепторы для гормонов. Антиидиотипические антитела