Советуем для ознакомления:

Вирусология:

Популярные разделы сайта:

Трансляция пикорнавирусов. Этапы трансляции пикорнавирусов

Освободившиеся от оболочки молекулы инфекционной вирусной РНК присоединяются 5'-концом к 45S-рибосомной субчастице, и вскоре начинается синтез белка. Этот процесс не требует предварительной транскрипции и образования кРНК, так как сама вРНК представляет собой мРНК и способна непосредственно транслироваться. Формальные доказательства этого факта накапливались годами. Было обнаружено, что зараженные полиовирусом клетки содержат необычно большие полисомы из 20—40 (в среднем 35) рибосом, распределенных вдоль мРНК, которая по молекулярному весу и нуклеотидному составу неотличима от вРНК (Пенмен и др., 1963, 1964).

Такие полисомы синтезировали белки, которые осаждались антисывороткой против полиовируса (Шарф и др., 1963; Уорнер и др., 1963). Окончательным доказательством матричной роли вРНК послужили эксперименты, показавшие, что в системе in vitro вРНК является матрицей для синтеза белков, пептидные карты которых сходны с пептидными картами белков зараженных клеток и содержат все пептиды, обнаруживаемые при анализе очищенных вирионов.

Молекула полиовирусной РНК не содержит точек пунктуации. В этом отношении она отличается от полицистронных матриц некоторых бактериальных вирусов. Рибосомы, присоединившись к 5'-концу РНК, продвигаются вдоль всей молекулы до тех пор, пока не натолкнутся на последовательность из 50 аденннов возле З'-конца. Таким образом синтезируется гигантский полипептид с мол. весом 250 000, соответствующий полному полиовирусному геному. Однако очень скоро этот «полипротеин» (Балтимор, 1971а) определенным образом расщепляется протеолитическими ферментами.

Посттрансляциониое расщепление было продемонстрировано следующими экспериментами: зараженные вирусом клетки метили радиоактивными аминокислотами очень короткое время (импульсная метка), а затем проводили так называемый чейз, т. е. вносили избыток немеченых аминокислот; при этом обнаруживали количественный переход радиоактивности из крупных белков во все более и более мелкие. Строгим подтверждением того, что мелкие вирусные полипептиды действительно представляют собой продукты расщепления короткоживущих высокомолекулярных предшественников, является совпадение пептидных карт предшественника и продуктов (Джекобсон, 1970).

Время жизни большого полипептида, соответствующего полному вирусному геному, очень невелико, и обнаружить его весьма непросто. Джекобсон и Балтимор (1958) показали, что этот белок образуется в присутствии аналогов аминокислот пли при температуре 43 °С, а также в присутствии диизопропилфторфосфата, ингибирующего расщепление (обзоры: Балтимор, 1971а; Балтимор и др., 1971). Кик и Холленд (1970), используя другой энтеровирус, Коксаки В1, сообщили, что высокомолекулярный белок легко выявляется на ранних стадиях цикла размножения, перед тем как в клетке накопятся большие количества расщепляющего фермента (ферментов), который, по их мнению, индуцируется вирусом.

пикорнавирусы

Позже Румянцев и др. (1971) обнаружили, что часть белков, которые синтезируются in vitro на связанных с мембранами полисомах из зараженных полиовирусом клеток HeLa, остаются в значительной степени нерасщепленными.

В выборе точек расщепления предполагаемым протеолитическим ферментом (ферментами) может существовать некоторая неоднозначность (Купер и др., 1970b). Однако обычно полипептид-предшественник расщепляется в специфических точках и в определенной последовательности, что приводит к образованию функциональных белков, которые сейчас хорошо известны. Последовательность этих событий изображена на рисунке. Полипептид NCVP00 представляет собой продукт трансляции полного полиовирусного генома. Еще будучи связан с рибосомой, он расщепляется в двух местах с образованием полипептидов NCVP1, NCVP2 и NCVPX (Джекобсон и Балтимор, 1970).

На основании генетической карты, составленной при помощи рекомбинационных экспериментов с использованием температурочувствительных мутантов, показано, что полипептид NCVP2 представляет собой вирусную полимеразу I (или этот фермент является его составной частью); менее обоснованы предположения, что полипептид NCVPX— это полимераза II или сигма-фактор, придающий вирусную специфичность полимеразе клетки-хозяина (Купер, 1969; Купер и др., 1971).

Полипептид NCVP1 содержит все структурные полипептиды вирусного капсида; в результате второй стадии расщепления (которая иногда происходит до завершения синтеза NCVP00, но обычно на несколько минут позже этого момента) он превращается в полипептиды VP0, VP1 и VP3, совпадающие по электрофоретической подвижности с тремя структурными белками пустых вирионов и имеющие с ними почти идентичные карты пептидов, полученных при триптическом гидролизе (Балтимор, 1971а). Конечное расщепление полипептидов VP0 на VP2 и VP4 происходит через 20—30 мин, совпадая по времени со сборкой зрелых вирионов из РНК и белка; этот этап мы подробно рассмотрим ниже.

Детальному изучению механизмов синтеза белка способствовало совершенствование бесклеточных систем (см. обзоры: Люка-Ленар и Липман, 1971, Филлипси Сайдискис, 1971). Уорнер и др. (1963) сумели показать, что полиовирусная РНК транслируется in vitro на рибосомах Е. coli с образованием белка, осаждающегося антисывороткой против полиовирионов. Впоследствии Рекош и др. (1970) методом пептидных карт показали, что рибосомы Е. coli транслируют полиовирусную РНК столь же эффективно, как и РНК фага f2, но образующиеся при этом белки значительно меньше, чем полипептид NCVP00.

В данной бактериальной бесклеточной системе инициация происходит в нескольких точках, причем каждый образующийся белок начинается с N-формилметионина. В связи с этим бактериальные системы в значительной мере теряют свою привлекательность для изучения трансляции РНК вирусов животных. Однако, к счастью, в настоящее время разрабатываются удовлетворительные бесклеточные системы животного происхождения. Как впервые показано несколько лет назад, РНК вируса энцефаломиокардита эффективно транслируется in vitro на рибосомах из мышиной асцитной опухоли Кребса (Керр и Мартин, 1971).

Рибосомы из ретикулоцитов кролика способны правильно транслировать РНК энтеровирусов с образованием высокомолекулярного специфического белка (Мэтьюс и Корнер, 1970). Рибосомы из клеток человека (HeLa) транслируют РНК любых кардиовирусов почти так же хорошо, как это делают рибосомы мышиного происхождения (из асцитных клеток или L-клеток), если в систему внесены определенные растворимые факторы из мышиных клеток (Эгген и Шаткин, 1972).

«Капризы» белоксинтезирующих бесклеточных систем из клеток животных сейчас достаточно хорошо изучены и поддаются контролю, что позволяет начать интенсивное использование бесклеточных систем для исследования тонких механизмов регуляции процесса трансляции, а также механизма действия интерферона, вирус-индуцированных репрессоров клеточного белкового синтеза и поздних вирусных белков, подавляющих выражение ранних вирусных генов.

- Читать далее "Синтез молекул РНК пикорнавирусов. Этапы синтеза РНК пикорнавирусов"

Оглавление темы "РНК вирусы. Пикорнавирусы":
1. Размножение РНК вирусов. Транскрипция и трансляция РНК вирусов
2. Репликация РНК вирусов. Почкование РНК вирусов
3. Регуляция РНК вирусов. Активность РНК вирусов
4. Синтез РНК вирусов. Цикл размножения пикорнавирусов
5. Начальные стадии пикорнавирусных инфекций. Поражения пикорнавирусами
6. Трансляция пикорнавирусов. Этапы трансляции пикорнавирусов
7. Синтез молекул РНК пикорнавирусов. Этапы синтеза РНК пикорнавирусов
8. Регуляция синтеза РНК пикорнавирусов. Ферменты синтеза РНК пикорнавирусов
9. Сборка пикорнавирусов. Этапы сборки пикорнавирусов
10. Регуляция выражения генов пикорнавирусов. Механизмы представления генов пикорнавирусов