Советуем для ознакомления:

Вирусология:

Популярные разделы сайта:

Селекция и накопление ts-мутантов вирусов. Использование ts-мутантов вирусов

Поскольку ts-мутанты занимают сейчас столь важное место в генетике вирусов, в этом и следующем разделах мы остановимся на некоторых деталях их селекции, накопления и использования. Обязательное условие работы с fc-мутантами — наличие хорошего метода бляшек. Препарат вируса клонируют при рестриктивной температуре, чтобы освободить его от возможной примеси спонтанных мутантов. Затем можно вести селекцию спонтанных ts-мутантов из бляшек, образовавшихся при пермиссивной температуре, путем исследования содержащегося в них вируса при пермиссивной и рестриктивной_ температурах (см., например, Флэманд, 1970; Херст и Понс, 1972). Чаще, однако, клонированный вирус обрабатывают мутагеном либо in vitro, либо во время цикла репродукции при пермиссивной температуре. Большая часть обработанного вируса при этом инактивируется. Необходимо принять меры, чтобы вирусная суспензия не содержала агрегатов. Выживший вирус используют, чтобы получить бляшки при пермиссивной температуре, а затем большое число таких бляшек тестируют при пермиссивной и рестриктивной температурах, осуществляя таким образом отбор предполагаемых fc-мутантов. В этих опытах необходим строгий контроль температуры, который лучше всего достигается погружением лотков с культуральными флаконами в водяную баню.

Получение ts-мутантов — дело нетрудное; иногда даже большинство вирионов, сохранившихся после обработки мутагеном, оказываются в какой-то степени термочувствительными (Сэмбрук и др., 1966). Гораздо труднее отобрать полезные типы мутантов и накопить их в необходимых для работы количествах. В большинстве случаев желательно работать с мутантами, имеющими единичную ts-мутацию; между тем такие мутанты могут легко ревертировать во время приготовления рабочих препаратов. Другое ограничение связано с тем, что многие ts-мутанты относятся к типу „leaky", и это делает их непригодными для использования в генетическом анализе или физиологических экспериментах. Вирусные суспензии, используемые в опытах по смешанной инфекции, должны состоять из хорошо диспергированных единичных вирионов, так как наличие агрегатов, содержащих генетически различные мутантные формы, может привести к искаженным результатам. В урожае некоторых оболочечных вирусов почти неизбежно появляются гетероплоиды (Саймон, 1972, см. ниже); это может быть абсолютным препятствием для проведения некоторых генетических экспериментов.

ts-мутанты вирусов

Использование ts-мутантов для анализа функций генов

Если при рестриктивной температуре происходит необратимое нарушение термочувствительной функции, то для того, чтобы определить, в каком гене — с ранней или поздней функцией— имеется дефект, можно использовать опыты со сменой температур. Существует два типа таких опытов. В экспериментах с повышением температуры («step-up» experiments) пробирки с зараженными клетками инкубируют сначала при пермиссивной температуре, а затем в различные сроки переносят их в условия рестриктивной температуры. В опытах с понижением температуры («step-down» experiments), наоборот, пробы сначала выдерживают при рестриктивной температуре, а затем охлаждают до пермиссивной температуры. В надлежащее время определяют титр инфекционного вируса во всех пробирках. При дефекте ранней функции (например, при дефектном синтезе вирусной нуклеиновой кислоты) получается высокий урожай в экспериментах с повышением температуры и низкий в опытах с понижением температуры. Если же температурочувствительный дефект затрагивает поздние стадии инфекционного цикла, например созревание вирионов, наблюдается обратная картина.

Еще один полезный тест — определение термостабильности вириона. Здесь выявляются случаи, в которых дефект затрагивает структурный белок или, возможно, температурочувствительную вирионную полимеразу. У некоторых родов вирусов для определения локализации ts-дефекта может быть использовано картирование на основе генетических рекомбинаций. Кроме того, с помощью радиоавтографии или по включению радиоактивных предшественников можно выяснить, образуется ли при рестриктивной температуре новая вирусная нуклеиновая кислота. И наконец, проводится изучение вирусных полипептидов с помощью иммунофлуоресцентной окраски клеток или других иммунологических тестов (особенно в тех случаях, когда имеются и антигенспецифические антитела и антитела к вирионам), а также путем электрофореза белков зараженных клеток в полиакриламидном геле; в случае ферментов исследуют их функциональную активность. Для онкогенных вирусов важным функциональным критерием является способность мутанта индуцировать и поддерживать трансформированное состояние клетки.

Может быть также полезным определение вирулентности ts-мутантов для экспериментальных животных. Прежде чем проводить эти функциональные тесты, мутантные штаммы обычно разделяют на группы с помощью комплементацион-ного анализа.

На последующих страницах мы приводим в краткой форме данные, полученные для различных групп вирусов животных. Для всестороннего анализа функции генов необходима, конечно, достаточно большая коллекция мутантов; покалишь немногие вирусы были подвергнуты адекватному исследованию, в том числе полиовирус (Купер), вирус Синдбис (Пфефферкорн) и вирус полиомы (ди Майорка, Экхарт). Превосходные системы имеются для реовирусов (Иоклик, Филдс), вируса везикулярного стоматита (Прингл, Флэманд) и аденовирусов (Уильяме); существенно расширяется использование ts-мутантов онкогенных вирусов, особенно SV40 и лейковирусов. Очень большие размеры генома у поксвирусов, иридовирусов и герпесвирусов делают всестороннее изучение функций их генов задачей весьма сложной, но многообещающей; на ее решение отважились в настоящее время Субак-Шарп и его коллеги, работающие с вирусом герпеса.

- Читать далее "Мутации полиовирусов. Характеристика мутаций полиовирусов"

Оглавление темы "Вирусные мутации":
1. Модификации вирусного генома. Мутации вирусов
2. Спонтанная мутация вирусов. Индуцированные мутации вирусов
3. Типы вирусных мутантов. Признаки вирусных мутантов
4. Бляшечные мутации вирусов. Вирусные мутанты адаптированные к холоду
5. Условно летальные мутанты вирусов. КВ-негативные мутанты аденовируса
6. Мутанты вируса полиомы. Температурочувствительные мутанты вирусов
7. Селекция и накопление ts-мутантов вирусов. Использование ts-мутантов вирусов
8. Мутации полиовирусов. Характеристика мутаций полиовирусов
9. Мутации вирусов Синдбис и вирусов леса Семлики. Мутации вируса везикулярного стоматита
10. Мутации реовирусов. Мутации вируса полиомы и обезьяньего вируса 40