Мак-Брайд и Уайнер (1964) обнаружили, что аденовирус типа 12 способен трансформировать in vitro культуры клеток почки новорожденного хомячка. В зараженных культурах через 8—10 нед появлялись выпуклые колонии эпителиальных клеток; клетки не образовывали вируса, но содержали Т-антиген аденовируса типа 12. На основе этих данных были разработаны более быстрые и легковоспроизводимые способы оценки трансформирующей активности разных серотипов аденовирусов с использованием нескольких типов клеток животных.

Подгруппы А, В, С и D соответствуют гемагглютинационным группам 4, 1, 3 и 2, и каждая подгруппа обладает специфическим Т-антигеном. Интересно, что, хотя аденовирусы, принадлежащие к подгруппам С и D, не вызывают опухолей у крыс, они трансформируют крысиные клетки с такой же эффективностью, как и высокоонкогенный аденовирус типа 12. Для трансформации одной клетки в культуру необходимо внести около 5-Ю7 инфекционных частиц. Отсюда следует, что результатом взаимодействия аденовируса с клетками лишь в редких случаях бывает трансформация; в большинстве случаев происходит размножение вируса с последующей гибелью клетки.

Именно поэтому так трудно получить перевиваемые линии трансформированных аденовирусом клеток человека. Однако было получено несколько линий крысиных и хомячковых клеток, трансформированных аденовирусами. Они образуют культуры с высокой плотностью, формируют колонии в агаре и после введения чувствительным хомячкам или крысам вызывают у них злокачественные опухоли.

Клетки, трансформированные аденовирусами in vitro или in vivo, по-видимому, не содержат поллого генома инфицировавшего вируса в состоянии, в котором он мог бы быть активирован или индуцирован (Ландау, 1966). Однако несколько трупп фактов свидетельствуют о том, что по меньшей мере некоторые гены аденовируса постоянно присутствуют в трансформированных клетках.

Вирусная ДНК в трансформированных клетках

Для определения количества вирусной ДНК в трансформированных клетках используют два метода гибридизации, впервые разработанные для полиомной системы. Первый метод, предложенный Вестфалем и Дульбекко (1968), заключается в следующем: сначала на матрице очищенной вирусной ДНК при помощи ДНК-зависимой РНК-полимеразы (полученной из клеток Е. coli) in vitro синтезируют меченую РНК с высокой удельной радиоактивностью; затем эту РНК подвергают отжигу с фиксированной на нитроцеллюлозных фильтрах ДНК из трансформированных или контрольных клеток.

Число копий вирусной ДНК, содержащихся в одной трансформированной клетке, рассчитывают на основании результатов реконструкционных опытов, в которых используют смесь нормальной клеточной ДНК и известных количеств вирусной ДНК.

Второй метод, разработанный Гельбом и др. (1971b), основан на том, что, согласно Бриттену и Кону (1968), скорость реассоциации любых последовательностей ДНК в растворе пропорциональна их концентрации. Следовательно, определив скорость реассоциации небольших количеств высокорадиоактивной ДНК в присутствии ДНК из трансформированных клеток, можно прямо рассчитать число копий вирусного генома в геномах трансформированных клеток. При этом отпадает необходимость в реконструкционных экспериментах. Оба метода очень чувствительны и способны выявить минимальные количества вирусной ДНК.

Однако полученные с их помощью данные о числе вирусных геномов, приходящихся на трансформированную клетку, несколько различаются между собой; при этом гибридизация ДНК и РНК на фильтрах дает всегда более высокие цифры.

Грин и сотр. (1970), применяя метод ДНК—РНК-гибридизации, показали, что все клеточные линии, трансформированные аденовирусами, несут множественные копии вирусной ДНК- В их опытах клетки хомячков, трансформированные аденовирусом типа 12, содержали 18—20 копий [(400——460) -106 дальтон ДНК] на диплоидный геном млекопитающего (3-1012 дальтон ДНК); клетки вызванной аденовирусом типа 7 опухоли хомячка содержали 28—30 копий, а крысиные клетки, трансформированные аденовирусом типа 2, содержали 7—10 копий.

Однако при исследовании той же самой линии крысиных клеток, трансформированных аденовирусом типа 2, методом кинетики реассоциации обнаружены только 1—2 копии вирусной ДНК на диплоидный клеточный геном (Грин, 1972; Петтерсон и Сэмбрук, 1973). Какой из этих методов дает более точные результаты, неизвестно. Пока ничего определенного не сообщалось о состоянии вирусной ДНК в трансформированных клетках, хотя имеются некоторые указания (Грин и др., 1970) на то, что она тесно связана с хромосомами.

- Читать далее "Транскрипция вирусных генов в трансформированных клетках. Гены вирусов в клетках хозяина"