Хотя вес ДНК вируса полиомы или SV40 составляет только около одной миллионной части веса клеточной ДНК, вирусную ДНК в трансформированных клетках можно обнаружить и количественно охарактеризовать с помощью двух методов гибридизации нуклеиновых кислот, обсуждавшихся ранее в этой главе и в гл. 2. Применяя РНК, синтезированную in vitro на матрице вирусной ДНК, для определения интегрированной вирусной ДНК, Вестфаль и Дульбекко (1968) обнаружили некоторую гибридизацию этой РНК с ДНК из нетрансформированных клеток; существенно большая гибридизация наблюдается с ДНК из трансформированных клеток. Различные трансформированные клеточные линии содержали разное число эквивалентов вирусного генома в пределах от 5 копий в некоторых линиях мышиных клеток, трансформированных вирусом полиомы, до 58 в клетках опухоли хомячка, индуцированной SV40. По мере улучшения методики гибридизации число вирусных геномов, приходящихся на клетку, полученное с использованием синтезированной in vitro вирусной РНК, уменьшалось (Вестфаль, личное сообщение; А. Левин и др., 1970). Большинство линий клеток, трансформированных SV40, содержит, как теперь полагают, примерно 2— 5 копий вирусной ДНК на клетку. Эта оценка находится в хорошем соответствии с величиной, равной 1—3 геномам на клетку, полученной Гэльбом и сотр. (1971b) с помощью метода кинетики ренатурации.

Состояние вирусной ДНК в одной линии мышиных клеток, трансформированных SV40, было исследовано Сэмбруком и сотр. (1968). Применяя методику гибридизации ДНК и РНК, они нашли, что все определяемые последовательности вирусной ДНК остаются связанными с высокомолекулярной клеточной ДНК как при зональном, так и при равновесном центрифугировании в щелочных градиентах. Свободных кольцевых молекул ДНК, содержащих вирусные последовательности, найдено не было. Из этих экспериментов видно, что ДНК SV40 ковалентно связана с хромосомной ДНК трансформированной клетки. О локализации вирусных последовательностей в клеточном геноме ничего не известно.

Физические доказательства интеграции были подтверждены изящными генетическими опытами Вайс и ее коллег (1968, 1970), которые использовали тот факт, что хромосомы человека в процессе клеточных делений гибридов мышиных и человеческих клеток постепенно теряются. Было найдено, что гибриды, полученные путем слияния трансформированных SV40 клеток человека с нормальными клетками мыши, сохраняют вирус-специфический Т-антиген до тех пор, пока в клетке остаются еще некоторые хромосомы человека. Поскольку синтез Т-антигена не удалось связать с какой-либо одной специфической хромосомой человека, эти результаты позволяют сделать следующие предположения:
1) в каждой трансформированной клетке вирусные геномы связаны со многими разными хромосомами;

2) клетки содержат немного геномов SV40, но в разных клетках одной и той же трансформированной клеточной линии эти геномы локализованы в различных хромосомах.

Транскрипция вирусных генов в трансформированных клетках. Первое определенное доказательство того, что вирусная ДНК в трансформированных клетках служит матрицей для синтеза РНК, было получено Бенджамином (1966). Методом импульсной метки он показал, что РНК из клеток, трансформированных вирусом полномы и SV40, содержат последовательности оснований, гомологичные последовательности ДНК трансформирующего вируса.

Эти результаты стимулировали работу многих групп исследователей, направленную на определение транскрибируемых участков вирусного генома. Интерес к этим участкам объясняется тем, что они должны кодировать вирусные функции, необходимые для поддержания клеток в трансформированном состоянии. Были получены результаты, свидетельствующие о том, что:
1) доля вирус-специфической РНК в общем количестве клеточной РНК очень мала — 0,01% (Бенджамин, 1966);

2) вирусная РНК из трансформированных клеток может конкурировать в гибридизационных тестах «примерно с 80% вирусных последовательностей, транскрибируемых на раннем этапе литической инфекции, и с 30—40% последовательностей РНК, выявляемых на поздних стадиях продуктивного процесса (Алони и др., 1968; Зауэр и Кидуэй, 1968; Ода и Дульбекко, 1968; Тонегава и др., 1970; Зауэр, 1971).

Эти результаты позволили считать, что в трансформированных клетках транскрибируется большая часть «ранних» последовательностей вирусной ДНК и небольшая часть «поздних» последовательностей, в общем около 40% генома SV40. Однако этот результат, по-видимому, не согласуется с данными опытов по насыщенной гибридизации, которые показывают, что в некоторых клеточных линиях транскрибируется до 100% вирусного генома (Мартин и Аксельрод, 1969а). Возможное разрешение парадокса состоит, вероятно, в том, что по меньшей мере в одной линии трансформированных клеток наряду с РНК, соответствующей всем истинно «ранним» и небольшой части «поздних» генов, синтезируется РНК, которая является «антипоздней» (Сэмбрук и др., 1972). Об этом свидетельствовали результаты гибридизации РНК с разделенными «ранней» или «поздней» нитями вирусной ДНК. Так как «антипоздняя» РНК не могла быть обнаружена в более ранних экспериментах по конкурентной гибридизации, но должна была выявляться в прямых опытах с насыщением, этим, по-видимому, объясняются различия в результатах, полученных в двух системах. В ядрах мышиных клеток, трансформированных SV40, найдены гигантские молекулы РНК (4*106), состоящие из ковалентно связанных последовательностей вирусной и клеточной РНК (Линдберг и Дарнел, 1970; Тонегава и др., 1970; Уолл и Дарнелл, 1971). Эти молекулы скорее всего возникают при транскрипции интегрированного генома SV40 под действием РНК-полимеразы, «проскочившей» при считывании с клеточной ДНК на вирусную, или наоборот. В пользу этого предположения говорит тот факт, что интерферон не подавляет трансляции мРНК для Т-антигена в трансформированных клетках, но угнетает синтез Т-антигена в продуктивном цикле размножения (Оксмэн и Блэк, 1966; Оксмэн и др., 1967).

В противоположность ядерной РНК менее крупные SV40 специфические молекулы РНК, обнаруживаемые на полирибосомах трансформированных клеток, не связаны с РНК хозяина (Уолл и Дарнел, 1971). Имеются некоторые доказательства, полученные методом вытеснения импульсной метки, в пользу того, что цитоплазматическая РНК вируса образуется из высокомолекулярных ядерных предшественников (Тонегава и др., 1970, 1971).

- Вернуться в оглавление раздела "Вирусология"