Советуем для ознакомления:

Вирусология:

Популярные разделы сайта:

Обнаружение вирусной ДНК с помощью гибридизации. Транскрипция вирусных генов

Хотя вес ДНК вируса полиомы или SV40 составляет только около одной миллионной части веса клеточной ДНК, вирусную ДНК в трансформированных клетках можно обнаружить и количественно охарактеризовать с помощью двух методов гибридизации нуклеиновых кислот, обсуждавшихся ранее в этой главе и в гл. 2. Применяя РНК, синтезированную in vitro на матрице вирусной ДНК, для определения интегрированной вирусной ДНК, Вестфаль и Дульбекко (1968) обнаружили некоторую гибридизацию этой РНК с ДНК из нетрансформированных клеток; существенно большая гибридизация наблюдается с ДНК из трансформированных клеток. Различные трансформированные клеточные линии содержали разное число эквивалентов вирусного генома в пределах от 5 копий в некоторых линиях мышиных клеток, трансформированных вирусом полиомы, до 58 в клетках опухоли хомячка, индуцированной SV40. По мере улучшения методики гибридизации число вирусных геномов, приходящихся на клетку, полученное с использованием синтезированной in vitro вирусной РНК, уменьшалось (Вестфаль, личное сообщение; А. Левин и др., 1970). Большинство линий клеток, трансформированных SV40, содержит, как теперь полагают, примерно 2— 5 копий вирусной ДНК на клетку. Эта оценка находится в хорошем соответствии с величиной, равной 1—3 геномам на клетку, полученной Гэльбом и сотр. (1971b) с помощью метода кинетики ренатурации.

Состояние вирусной ДНК в одной линии мышиных клеток, трансформированных SV40, было исследовано Сэмбруком и сотр. (1968). Применяя методику гибридизации ДНК и РНК, они нашли, что все определяемые последовательности вирусной ДНК остаются связанными с высокомолекулярной клеточной ДНК как при зональном, так и при равновесном центрифугировании в щелочных градиентах. Свободных кольцевых молекул ДНК, содержащих вирусные последовательности, найдено не было. Из этих экспериментов видно, что ДНК SV40 ковалентно связана с хромосомной ДНК трансформированной клетки. О локализации вирусных последовательностей в клеточном геноме ничего не известно.

Физические доказательства интеграции были подтверждены изящными генетическими опытами Вайс и ее коллег (1968, 1970), которые использовали тот факт, что хромосомы человека в процессе клеточных делений гибридов мышиных и человеческих клеток постепенно теряются. Было найдено, что гибриды, полученные путем слияния трансформированных SV40 клеток человека с нормальными клетками мыши, сохраняют вирус-специфический Т-антиген до тех пор, пока в клетке остаются еще некоторые хромосомы человека. Поскольку синтез Т-антигена не удалось связать с какой-либо одной специфической хромосомой человека, эти результаты позволяют сделать следующие предположения:
1) в каждой трансформированной клетке вирусные геномы связаны со многими разными хромосомами;

2) клетки содержат немного геномов SV40, но в разных клетках одной и той же трансформированной клеточной линии эти геномы локализованы в различных хромосомах.

вирусная днк

Транскрипция вирусных генов в трансформированных клетках. Первое определенное доказательство того, что вирусная ДНК в трансформированных клетках служит матрицей для синтеза РНК, было получено Бенджамином (1966). Методом импульсной метки он показал, что РНК из клеток, трансформированных вирусом полномы и SV40, содержат последовательности оснований, гомологичные последовательности ДНК трансформирующего вируса.

Эти результаты стимулировали работу многих групп исследователей, направленную на определение транскрибируемых участков вирусного генома. Интерес к этим участкам объясняется тем, что они должны кодировать вирусные функции, необходимые для поддержания клеток в трансформированном состоянии. Были получены результаты, свидетельствующие о том, что:
1) доля вирус-специфической РНК в общем количестве клеточной РНК очень мала — 0,01% (Бенджамин, 1966);

2) вирусная РНК из трансформированных клеток может конкурировать в гибридизационных тестах «примерно с 80% вирусных последовательностей, транскрибируемых на раннем этапе литической инфекции, и с 30—40% последовательностей РНК, выявляемых на поздних стадиях продуктивного процесса (Алони и др., 1968; Зауэр и Кидуэй, 1968; Ода и Дульбекко, 1968; Тонегава и др., 1970; Зауэр, 1971).

Эти результаты позволили считать, что в трансформированных клетках транскрибируется большая часть «ранних» последовательностей вирусной ДНК и небольшая часть «поздних» последовательностей, в общем около 40% генома SV40. Однако этот результат, по-видимому, не согласуется с данными опытов по насыщенной гибридизации, которые показывают, что в некоторых клеточных линиях транскрибируется до 100% вирусного генома (Мартин и Аксельрод, 1969а). Возможное разрешение парадокса состоит, вероятно, в том, что по меньшей мере в одной линии трансформированных клеток наряду с РНК, соответствующей всем истинно «ранним» и небольшой части «поздних» генов, синтезируется РНК, которая является «антипоздней» (Сэмбрук и др., 1972). Об этом свидетельствовали результаты гибридизации РНК с разделенными «ранней» или «поздней» нитями вирусной ДНК. Так как «антипоздняя» РНК не могла быть обнаружена в более ранних экспериментах по конкурентной гибридизации, но должна была выявляться в прямых опытах с насыщением, этим, по-видимому, объясняются различия в результатах, полученных в двух системах. В ядрах мышиных клеток, трансформированных SV40, найдены гигантские молекулы РНК (4*106), состоящие из ковалентно связанных последовательностей вирусной и клеточной РНК (Линдберг и Дарнел, 1970; Тонегава и др., 1970; Уолл и Дарнелл, 1971). Эти молекулы скорее всего возникают при транскрипции интегрированного генома SV40 под действием РНК-полимеразы, «проскочившей» при считывании с клеточной ДНК на вирусную, или наоборот. В пользу этого предположения говорит тот факт, что интерферон не подавляет трансляции мРНК для Т-антигена в трансформированных клетках, но угнетает синтез Т-антигена в продуктивном цикле размножения (Оксмэн и Блэк, 1966; Оксмэн и др., 1967).

В противоположность ядерной РНК менее крупные SV40 специфические молекулы РНК, обнаруживаемые на полирибосомах трансформированных клеток, не связаны с РНК хозяина (Уолл и Дарнел, 1971). Имеются некоторые доказательства, полученные методом вытеснения импульсной метки, в пользу того, что цитоплазматическая РНК вируса образуется из высокомолекулярных ядерных предшественников (Тонегава и др., 1970, 1971).

- Вернуться в оглавление раздела "Вирусология"

Оглавление темы "Медленные вирусные инфекции":
1. Вирусспецифические репрессоры. Вирус полиомы
2. Обезьяний вирус. Онкогенность обезьянного вируса
3. Вирус полиомы в культуре клеток. Обезьяний вирус и клетки
4. Инфекция обезьяньего вируса. Непродуктивная инфекция вируса SV40
5. Абортивная трансформация клеток. Хромосомная вирусная патология
6. Эффективность трансформации клеток. Свойства трансформированных клеток
7. Рост трансформированных вирусом клеток. Трансплантационные антигены
8. Поверхностные антигены трансформированных клеток. Реакция с лектинами
9. Гены вирусов в трансформированных клетках. Спасение инфекционного вируса
10. Обнаружение вирусной ДНК с помощью гибридизации. Транскрипция вирусных генов