Некоторые вирусы животных можно очистить, используя характерные свойства их вирионов. Например, вирус гриппа концентрируют и очищают при помощи адсорбции на эритроцитах при 4 °С. Затем клетки отмывают от примесей и повышают температуру до 37°С. В этих условиях начинает функционировать фермент нейраминидаза, являющийся составной частью вирионов; он разрушает вирусные рецепторы на эритроцитах, в результате чего вирусные частицы высвобождаются.

Эритроциты удаляют низкоскоростным центрифугированием (Эйда и Перри, 1954). Однако для большинства вирусов животных нет аналогичного удобного и быстрого способа очистки; поэтому для получения чистой суспензии вируса приходится применять последовательно различные методы фракционирования. Так как обычно исходным материалом служит среда, инфицированные клетки или жидкости тела, объем которых велик и в которых содержится небольшое число вирионов, первый этап очистки часто состоит в концентрировании вирусных частиц путем осаждения сульфатом аммония, полиэтиленгликолем или этанолом или путем адсорбции на ионообменных смолах.

Компоненты хозяина, отличающиеся по размерам от изучаемого вируса, отделяют, как правило, дифференциальным центрифугированием: при низкоскоростном центрифугировании удаляют крупные обломки клеток (клеточный детрит), а для осаждения вируса используют последующее высокоскоростное центрифугирование.

Скоростное зональное центрифугирование. Дальнейшая очистка обычно достигается с помощью скоростного зонального центрифугирования в градиенте плотности. Для создания градиентов подобного рода наиболее широко применяют забуференные растворы сахарозы или глицерина; вирусы, устойчивые в растворах высокой ионной силы, можно с успехом выделять, используя такие соли, как бромид или тартрат калия. Градиент готовят непосредственно в центрифужных пробирках, смешивая растворы различной концентрации так, чтобы плотность непрерывно и линейно уменьшалась от дна до верха пробирки.

Препарат вируса наносят на градиент, и во время центрифугирования он осаждается в виде зоны со скоростью (коэффициент седиментации S), обусловленной размером и массой вирусных частиц и заранее предсказуемой на основании классической теории центрифугирования. Центрифугирование обычно заканчивают, когда вирусная зона пройдет от половины до двух третей длины градиента. Для сбора фракций либо прокалывают дно пробирки, либо с помощью специального устройства накачивают на дно пробирки плотный раствор, измеряя объем вытекающей жидкости. Положение вирусной полосы определяют спектрофотометрически или по радиоактивности.

Равновесное (изопикническое) центрифугирование в градиенте плотности. Вирионы можно отделить от других частиц с близкими коэффициентами седиментации, используя метод равновесного градиентного центрифугирования, основанный на различиях плавучей плотности вирионов и контаминирующих частиц. Вирионы суспендируют в растворах, имеющих высокую плотность и низкую вязкость, обычно в растворах хлоридов щелочных металлов, например в хлориде цезия.

Во время высокоскоростного центрифугирования ионы металла образуют стабильный градиент плотности, крутизна которого определяется равновесием, устанавливающимся между тенденцией тяжелых ионов осаждаться ч скоростью их обратной диффузии из более концентрированной в менее концентрированную зону. По мере установления градиента вирусные частицы мигрируют в ту его зону, где их плотность будет равна плотности поддерживающей среды. После достижения равновесия центрифугу останавливают, зону вируса собирают, а солевой раствор удаляют диализом или пропусканием через колонку с сефадексом.

- Вернуться в оглавление раздела "Вирусология"