Советуем для ознакомления:

Вирусология:

Популярные разделы сайта:

Очистка вирусов. Скоростное зональное центрифугирование

Некоторые вирусы животных можно очистить, используя характерные свойства их вирионов. Например, вирус гриппа концентрируют и очищают при помощи адсорбции на эритроцитах при 4 °С. Затем клетки отмывают от примесей и повышают температуру до 37°С. В этих условиях начинает функционировать фермент нейраминидаза, являющийся составной частью вирионов; он разрушает вирусные рецепторы на эритроцитах, в результате чего вирусные частицы высвобождаются.

Эритроциты удаляют низкоскоростным центрифугированием (Эйда и Перри, 1954). Однако для большинства вирусов животных нет аналогичного удобного и быстрого способа очистки; поэтому для получения чистой суспензии вируса приходится применять последовательно различные методы фракционирования. Так как обычно исходным материалом служит среда, инфицированные клетки или жидкости тела, объем которых велик и в которых содержится небольшое число вирионов, первый этап очистки часто состоит в концентрировании вирусных частиц путем осаждения сульфатом аммония, полиэтиленгликолем или этанолом или путем адсорбции на ионообменных смолах.

Компоненты хозяина, отличающиеся по размерам от изучаемого вируса, отделяют, как правило, дифференциальным центрифугированием: при низкоскоростном центрифугировании удаляют крупные обломки клеток (клеточный детрит), а для осаждения вируса используют последующее высокоскоростное центрифугирование.

очистка вирусов

Скоростное зональное центрифугирование. Дальнейшая очистка обычно достигается с помощью скоростного зонального центрифугирования в градиенте плотности. Для создания градиентов подобного рода наиболее широко применяют забуференные растворы сахарозы или глицерина; вирусы, устойчивые в растворах высокой ионной силы, можно с успехом выделять, используя такие соли, как бромид или тартрат калия. Градиент готовят непосредственно в центрифужных пробирках, смешивая растворы различной концентрации так, чтобы плотность непрерывно и линейно уменьшалась от дна до верха пробирки.

Препарат вируса наносят на градиент, и во время центрифугирования он осаждается в виде зоны со скоростью (коэффициент седиментации S), обусловленной размером и массой вирусных частиц и заранее предсказуемой на основании классической теории центрифугирования. Центрифугирование обычно заканчивают, когда вирусная зона пройдет от половины до двух третей длины градиента. Для сбора фракций либо прокалывают дно пробирки, либо с помощью специального устройства накачивают на дно пробирки плотный раствор, измеряя объем вытекающей жидкости. Положение вирусной полосы определяют спектрофотометрически или по радиоактивности.

Равновесное (изопикническое) центрифугирование в градиенте плотности. Вирионы можно отделить от других частиц с близкими коэффициентами седиментации, используя метод равновесного градиентного центрифугирования, основанный на различиях плавучей плотности вирионов и контаминирующих частиц. Вирионы суспендируют в растворах, имеющих высокую плотность и низкую вязкость, обычно в растворах хлоридов щелочных металлов, например в хлориде цезия.

Во время высокоскоростного центрифугирования ионы металла образуют стабильный градиент плотности, крутизна которого определяется равновесием, устанавливающимся между тенденцией тяжелых ионов осаждаться ч скоростью их обратной диффузии из более концентрированной в менее концентрированную зону. По мере установления градиента вирусные частицы мигрируют в ту его зону, где их плотность будет равна плотности поддерживающей среды. После достижения равновесия центрифугу останавливают, зону вируса собирают, а солевой раствор удаляют диализом или пропусканием через колонку с сефадексом.

- Вернуться в оглавление раздела "Вирусология"

Оглавление темы "Культивирование вирусов":
1. Типы культивируемых клеток. Перевиваемые клеточные линии
2. Размножение вирусов в культарух клеток. Цитопатический эффект вирусов
3. Гемадсорбция вирусов. Куриные эмбрионы и лабораторные животные для роста вирусов
4. Инфекционность вируса. Определение инфекционности методом бляшек
5. Оценка инфекционности вирусов. Методы определения инфекционности
6. Особенности квантального определения инфекционности. Статистический аспект
7. Эффективность образования бляшек. Инфекционная ДНК
8. Инфекционная РНК. Значение инфекционности вирусных нуклеиновых кислот
9. Гемаглютинация вирусов. Прямой подсчет вирусных частиц
10. Очистка вирусов. Скоростное зональное центрифугирование