Абсолютных критериев чистоты вирусных препаратов не существует. К числу минимальных требований следует отнести следующие: частицы должны быть гомогенны при рассматривании их с помощью электронного микроскопа; дальнейшая очистка от каких-либо компонентов приводит к уменьшению инфекционности частиц; необходимо, чтобы в очищенном препарате вируса отсутствовали радиоактивные компоненты из меченых незаряженных клеток, подвергнутых совместной процедуре очистки.

Эти критерии выполняются для многих типов вирусов (например, вируса полиомы, аденовирусов, пикорнавирусов). Другие вирусы (например, РНК-содержащие онкогенные вирусы или коронавирусы) имеют такой же размер и плотность, как и компоненты неинфицированной клетки (Андерсон и др., 1966). Несмотря на многочисленные попытки, эти вирусы до сих пор не удалось удовлетворительно очистить, и дальнейшие успехи в изучении их химического состава зависят от разработки новых или совершенствования уже имеющихся методов очистки.

Тем, что нам сейчас известно относительно биохимических процессов, происходящих в результате инфекции, мы обязаны радиоактивным маркерам. Радиоактивные молекулы, поступая во все внутриклеточные фонды, используются точно так же, как и нерадиоактивные, но именно благодаря тому, что они мечены, их метаболизм и судьба в клетке легко прослеживаются. Однако необходимо иметь в виду, что мы все еще очень немного знаем о внутриклеточной компартментализации тех или иных фондов метаболитов.

При изучении вирусов животных чаще всего используют следующие радиоактивные изотопы: 3Н, ИС, 32Р, 35S и 1251 или 13Ч; присутствие их обычно регистрируют с помощью сцинтилляционной спектроскопии. В большинстве случаев изотопы добавляют к клеткам не в виде свободных атомов, а в виде соединений-предшественников, которые используются в синтезе специфических клеточных компонентов. Например, для изучения синтеза белка добавляют меченые аминокислоты, для синтеза РНК — уридин, для ДНК — тимидин, для гликопротеидов — глюкозамин и для синтеза липидов — холин.
Используя смесь предшественников, меченных, например, 3Н и 14С, можно одновременно проследить за двумя метаболическими путями (эксперименты с двойной меткой).

Выбор предшественника и его удельной радиоактивности зависит от цели эксперимента. Если в качестве предшественника используют меченый уридин, то он в основном включается в РНК. Однако он может также превращаться в дУМФ и дЦМФ и таким образом включаться в ДНК. Чтобы избежать этого, используют 5-3Н-уридин, так как при превращении дУМФ в дТМФ, заключающемся в восстановительном метилировании в положении 5, тритий из молекулы удаляется.

Специфическим предшественником ДНК является тимидин, и при блокировании эндогенного синтеза дТМФ фтордез оксиуридином экзогенный тимидин с увеличенной скоростью включается в ДНК большинства клеток.

В общем необходимо отметить, что интерпретировать результаты экспериментов с применением радиоактивной метки следует с осторожностью. Так, изменение скорости поглощения или включения предшественника может отражать изменение размера внутриклеточного фонда, а не изменение скорости синтеза макромолекул. Кроме того, концентрация и радиоактивность экзогенного изотопа не должны лимитировать скорости синтезов.

При использовании предшественников, характеризующихся высокой удельной радиоактивностью, в частности тритиированного тимидина, клеточные функции могут нарушаться из-за эффекта облучения. Если не упускать из виду эти обстоятельства, радиоактивные изотопы служат эффективным средством для детального анализа действия вирусов животных на клетки. Кроме того, с помощью радиоактивных изотопов были получены препараты меченых вирусов, что не только обеспечило анализ состава и строения вирусных частиц, но и позволило применять микроманипуляции, облегчающие работу исследователя.

- Читать далее "Электронная микроскопия вирусов. Гибридизация вирусов"