Вирусология

Для изучения морфологии вирусных частиц и их размножения в зараженной клетке обычно применяют несколько различных методов. Метод негативного контрастирования, введенный в вирусологию Бреннером и Хорном (1959), оказался чрезвычайно эффективным для выявления деталей организации вирусных частиц (см. обзор Хориа, 1967). При нейтральном рН фосфорновольфрамовая кислота плохо взаимодействует с белками или нуклеиновыми кислотами; после высушивания она создает относительно однородный, малопроницаемый для электронов фон, на котором четко выделяются такие небольшие объекты, как вирионы.

Так как фосфорновольфрамовая кислота проникает в промежутки между макромолекулами, этот метод в сочетании с большим увеличением позволяет обнаружить тончайшие детали структуры вирусов.

Важные сведения о структуре и морфогенезе вирусов дает также метод тонких срезов, используемый для изучения препаратов вирусов, находящихся в осадке, или чаще препаратов зараженных клеток (обзор Моргана и Роуза, 1967). Для того чтобы установить локализацию специфических вирусных белков в вирусной частице или в зараженной клетке, используют вспомогательные методы, например радиоавтографию, обработку тонких срезов антитела ми, меченными ферритином, или антителами, меченными пероксидазой хрена.

И наконец, для изучения вирусных нуклеиновых кислот все больше используется метод Кляйншмидта (1968), позволяющий получать препараты «расправленных» по длине нуклеиновых кислот, а затем после напыления металлом или лучше в темном поле фотографировать такие молекулы. В случае двухцепочечной молекулы ДНК длина в 1 мкм приблизительно соответствует молекулярному весу 2-106 дальтон. К недавнему усовершенствованию этого метода следует отнести разработку техники прямого визуального обнаружения гетеродуплексов ДНК при изучении гомологии между нуклеиновыми кислотами родственных вирусов.

Гибридизация (отжиг) нуклеиновых кислот — это взаимодействие одноцепочечной полинуклеотидной цепи с комплементарной последовательностью оснований, приводящее к образованию двухцепочечной структуры. В зависимости от исходных компонентов продуктами реакции будут дуплексы РНК:РНК, РНК:ДНК или ДНК:ДНК, каждый из которых можно определить различными методами. Существует ряд прекрасных обзоров по наиболее часто используемым методам гибридизации. Мы в этом кратком разделе ограничимся описанием лишь двух основных методов и примерами их использования при изучении вирусов животных.

Препараты двухцепочечной нуклеиновой кислоты денатурируют нагреванием или щелочной обработкой и инкубируют в условиях, вызывающих отжиг полинуклеотидных цепей (нейтральный рН, температура на 25 °С ниже Тпл). Так как реассоциация полинуклеотидных цепей представляет собой бимолекулярную реакцию, отжиг подчиняется кинетике реакции второго порядка и скорость реакции зависит от концентрации нуклеиновой кислоты, ее размера, разнообразия нуклеотидных последовательностей, а также от концентраций солей в растворе. Образование нативной нуклеиновой кислоты может быть определено с помощью хроматографии на гидроксилапатите или с помощью нуклеаз, способных различать одно- или двухцепочечные нуклеиновые кислоты.

Хорошим примером использования метода гибридизации в растворе является определение числа копий вирусной ДНК в трансформированных клетках. Небольшие количества вирусной ДНК с высокой удельной радиоактивностью отжигают в присутствии больших количеств ДНК из трансформированных вирусом или контрольных клеток. Так как скорость отжига радиоактивной вирусной ДНК пропорциональна ее концентрации в растворе, гибридизация осуществляется быстрее в присутствии ДНК из трансформированных клеток, чем в присутствии контрольной клеточной ДНК- Анализируя кинетику отжига радиоактивной ДНК, можно прямо определить число вирусных копий в ДНК, экстрагированной из трансформированных клеток.

- Читать далее "Гибридизация ДНК вирусов. Нуклеиновые кислоты вирусов"