Советуем для ознакомления:

Вирусология:

Популярные разделы сайта:

Гибридизация ДНК вирусов. Нуклеиновые кислоты вирусов

ДНК денатурируют и иммобилизуют на нитроцеллюлозных фильтрах. Затем фильтры погружают в раствор радиоактивной нуклеиновой кислоты при условиях, благоприятных для гибридизации. Если раствор содержит какую-либо меченую нуклеиновую кислоту, последовательность оснований которой комплементарна ДНК, иммобилизованной на фильтре, произойдет гибридизация. Степень гибридизации определяют по величине специфически адсорбированной на фильтре радиоактивности. Этот метод был использован для определения синтеза вирус-специфических РНК в зараженных клетках.

Описано также множество других применений метода, причем используют разнообразные его модификации, например конкурентную гибридизацию, при которой иммобилизованную на фильтрах ДНК отжигают сначала с избытком немеченой РНК, а затем с меньшим количеством радиоактивной РНК. Если немеченая РНК содержит последовательности, полностью перекрывающиеся с последовательностями радиоактивной РНК, то метка на фильтре адсорбироваться не будет, так как все пригодные для связывания участки ДНК будут заняты.
Гибридизация меченой РНК произойдет в том случае, если последовательности меченой и немеченой РНК будут различны.

Используя такого рода эксперименты, можно определить, какой именно участок вирусного генома транскрибируется в различное время после начала инфекции. Гибридизация нуклеиновых кислот является, без сомнения, эффективным методом; простота и чувствительность делают его незаменимым при изучении обмена нуклеиновых кислот в инфицированных вирусом и трансформированных клетках.

Предположим, что мы выделили новый вирус и нам удалось получить суспензию очищенных вирусных частиц. Как идентифицировать его и как определить его химический состав? Помочь в этом нам может предыстория вируса, а именно сведения о том, из какого вида животного вирус выделен и имеет он отношение к заболеванию или нет. Этих данных в сочетании с электронно-микроскопическим исследованием окрашенных или неокрашенных частиц и их срезов иногда бывает достаточно для предварительной идентификации.

гибридизация днк

Если мы захотим узнать больше о физических и химических свойствах вируса, а также выяснить природу и размеры его генома, то в большинстве случаев эту информацию можно сравнительно легко получить с помощью перечисленных ниже методов.

Вид нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), которая входит в состав вируса в качестве его генетического материала, можно лучше всего определить прямым анализом углевода в нуклеиновой кислоте, экстрагированной из вируса горячим или холодным фенолом. Если в распоряжении исследователя имеется лишь небольшое количество вируса, то вполне пригодны другие, более простые и чувствительные методы. Например, если вирус вырастить в присутствии С-тимидина и 3Н-уридина, выделенная нуклеиновая кислота будет содержать только С-метку в том случае, если это ДНК, и только 3Н, если это РНК.

Является ли нуклеиновая кислота вируса одноцепочечной или двухцепочечной молекулой, можно определить с помощью ряда физико-химических методов: определения плавучей плотности, анализа нуклеотидного состава и кривых плавления. Однако самый простой метод заключается, по-видимому, в обработке нуклеиновой кислоты нуклеазами с известной специфичностью в отношении определенных типов нуклеиновых кислот.

В некоторых случаях этот способ определения может вызвать серьезные затруднения. Известны вирусы, например адено-ассоциированные вирусы, частицы которых содержат одноцепочечные молекулы ДНК, причем часть вирионов содержит одну цепь ДНК, а другая часть — комплементарную ей цепь. В процессе экстракции цепи соединяются, образуя двухцепочечную ДНК. Характер нуклеиновой кислоты у адено-ассоциированных вирусов был определен с помощью флуоресцентной микроскопии нефиксированных частиц, окрашенных акридиновым оранжевым. Акридиновый оранжевый связывается с нуклеиновой кислотой внутри частицы и при облучении ультрафиолетом дает зеленую флуоресценцию, если нуклеиновая кислота двухцепочечна, и оранжевую, если одноцепочечна.

И наконец, еще метод, не слишком надежный, но ранее широко использовавшийся. Метод основан на том, что 5-бромдезоксиуридин (бромурацилдезоксирибоза, БУдР) снижает выход некоторых вирусов из зараженных клеток. БУдР, являясь аналогом тимидина, включается в ДНК вместо обычного нуклеозида, что и приводит к ее инактивации. Поэтому предполагали, что если выход вируса в присутствии БУдР уменьшается, то его генетическим материалом служит ДНК.

В настоящее время известно, что для репликации некоторых типов РНК-содержащих вирусов (особенно РНК-содержащих опухолевых вирусов) необходим синтез ДНК на ранних стадиях инфекции, поэтому при тесте с БУдР эти вирусы вели бы себя как ДНК-содержащие.

- Читать далее "Диагностика вирусных нуклеиновых кислот. Белки вирусов"

Оглавление темы "Выявление вирусов":
1. Критерии чистоты вирусных препаратов. Радиоактивные изотопы в изучении вирусов
2. Электронная микроскопия вирусов. Гибридизация вирусов
3. Гибридизация ДНК вирусов. Нуклеиновые кислоты вирусов
4. Диагностика вирусных нуклеиновых кислот. Белки вирусов
5. Белковый состав морфологических субъединиц вирусов. Оболочки и ферменты вирусов
6. Антитела и антигены вирусов. Нейтрализация вирусов
7. Торможение гемаглютинации вирусов. Выявление вирусов диффузией в геле
8. Связывание комплемента для выявления вирусов. Техника связывания комплемента
9. Иммунофлуоресценция вирусов. Виды иммунофлуоресценции вирусов
10. Радиоиммунологические методы выявления вирусов. Техника радиоиммунных методов