Советуем для ознакомления:

Вирусология:

Популярные разделы сайта:

Диагностика вирусных нуклеиновых кислот. Белки вирусов

Размер молекулы (молекул) нуклеиновой кислоты, составляющей геном вируса, можно определить различными способами. Если вирус содержит одно- или двухцепочечную ДНК, то весьма удобно пользоваться методами центрифугирования; однако лучшим методом в настоящее время признан метод прямого электронно-микроскопического изучения нуклеиновой кислоты по способу Кляйншмидта (Кляйншмидт, 1968). Для двухцепочечной ДНК длина в 1 мкм эквивалентна приблизительно 2-106 дальтон. Этот метод позволяет также получить некоторые сведения о топологии ДНК, например кольцевая она или линейная, и если кольцевая, то сверхспиральна она или нет.

Определение структуры РНК представляет собой более сложную задачу. Во многих случаях это обусловлено, с одной стороны, агрегацией молекул, а с другой — возможностью их разрушения под действием нуклеаз. Кроме того, пока не существует надежного метода определения длины РНК с помощью электронного микроскопа. Известны, однако, прекрасные методы определения молекулярного веса РНК с помощью электрофореза в полиакриламиде или агарозе или седиментации в денатурирующих растворителях, таких, как 99%-ный диметилсульфоксид. При использовании достаточного количества калибровочных маркеров эти методы очень точны и надежны.

После определения молекулярного веса молекул нуклеиновой кислоты, экстрагированной из вируса, необходимо решить, сколько молекул каждого класса содержится в одной вирусной частице. Накопленные к настоящему времени химические данные показывают, что каждая частица аденовирусов, вирусов полиомы, поксвирусов, герпесвирусов и пикорнавирусов содержит только одну молекулу нуклеиновой кислоты, однако в случае некоторых РНК-содержащих вирусов высказать определенное мнение довольно трудно. Например, геном реовирусов, лейковирусов и вируса гриппа содержит более чем одну молекулу РНК.

Тем не менее мы не можем с полной уверенностью сказать, сколько именно молекул РНК составляют геном. При отсутствии полных генетических карт единственный путь, позволяющий определить состав генома таких частиц, состоит в том, чтобы попытаться подобрать различные комбинации молекул РНК, в сумме дающих то количество РНК, которое обнаруживается при химическом анализе очищенных частиц. Во многих случаях подобное определение относится скорее к области догадки, чем научного исследования.

нуклеиновые кислоты

Информацию о размере и наборе белков, присутствующих в вирусной частице, обычно получают с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Акриламид полимеризуют в виде столбика или пластины и сверху наносят смесь анализируемых белков. При пропускании через гель электрического тока белки мигрируют в геле как отдельные зоны со скоростями, которые определяются, во-первых, зарядом белковой молекулы в данной буферной системе и, во-вторых, размерами пор геля. Небольшие белковые молекулы проходят через поры, образованные сшивками полиакриламида, легче, чем более крупные белки, и таким образом движутся быстрее.

Используя концентрации акрил-амида от 5 до 15%, можно легко получить гели с размерами пор, пригодными для разделения белков с широким спектром молекулярных весов. Положение белковой полосы определяют, либо окрашивая фиксированный гель красителем типа кумасси ярко-синий, либо с помощью метода радиоавтографии, либо подсчитывая радиоактивность каждой фракции, полученной после разрезания геля на небольшие сегменты. При электрофорезе в полиакриламидном геле обычно используют одну из двух систем: а) система с денатурирующими свойствами. Перед нанесением на гель проводят диссоциацию белков на составляющие их полипептидные цепи.

Для этого чаще всего белки прогревают при 80 °С в течение нескольких минут в присутствии восстанавливающих агентов, таких, как дитиотреитол или меркаптоэтанол, и анионного детергента додецилсульфата натрия. Детергент связывается с диссоциированными цепями, в результате чего все цепи становятся отрицательно заряженными. Полипептиды делятся в геле только на основании различий в их размерах: все различия в зарядах элиминируются. При соблюдении определенных предосторожностей метод дает возможность выявить набор всех полипептидов, присутствующих в данном вирусном препарате, и, если полипептиды не представляют собой производных гликопротеидов, аномально ведущих себя при форезе, исключительно точно оценить молекулярные веса изучаемых полипептидов, б) Система, не обладающая денатурирующими свойствами.

Эта система применяется в тех случаях, когда необходимо сохранить нативное состояние белков и разделить в геле нативные белки, а не соответствующие им полипептиды. Поскольку в отсутствие додецилсульфата натрия миграция белков зависит не только от их молекулярного веса, но и от их общего заряда, буферные системы подбираются с учетом свойств изучаемого белка.

- Читать далее "Белковый состав морфологических субъединиц вирусов. Оболочки и ферменты вирусов"

Оглавление темы "Выявление вирусов":
1. Критерии чистоты вирусных препаратов. Радиоактивные изотопы в изучении вирусов
2. Электронная микроскопия вирусов. Гибридизация вирусов
3. Гибридизация ДНК вирусов. Нуклеиновые кислоты вирусов
4. Диагностика вирусных нуклеиновых кислот. Белки вирусов
5. Белковый состав морфологических субъединиц вирусов. Оболочки и ферменты вирусов
6. Антитела и антигены вирусов. Нейтрализация вирусов
7. Торможение гемаглютинации вирусов. Выявление вирусов диффузией в геле
8. Связывание комплемента для выявления вирусов. Техника связывания комплемента
9. Иммунофлуоресценция вирусов. Виды иммунофлуоресценции вирусов
10. Радиоиммунологические методы выявления вирусов. Техника радиоиммунных методов