Советуем для ознакомления:

Вирусология:

Популярные разделы сайта:

Торможение гемаглютинации вирусов. Выявление вирусов диффузией в геле

Антитела могут подавлять вызываемую вирусом гемагглютинацию (ГА), блокируя определенные, вызывающие это явление специфические антигены на поверхности вириона. Реакция торможения гемагглютинации (ТГ) проводится следующим образом (Розен, 1969). Исследуемую сыворотку вначале обрабатывают для разрушения неспецифических ингибиторов ГА. Например, существует два вида ингибиторов ГА, вызываемой вирусом гриппа: гликопротеиды сыворотки, которые можно разрушить периодатом, трипсином или разрушающим рецепторы ферментом Vibrio cholerae, и термолабильные ингибиторы, разрушающиеся в результате прогревания при 56 °С в течение 30 мин.

После обработки сыворотку разводят в пластмассовых пластинах с помощью откалиброванной проволочной петли. В каждую лунку калиброванной капельной пипеткой вносят 4—5 «агглютинирующих» доз вируса и таким же образом добавляют эритроциты того или иного вида животного. Пластину оставляют на время, необходимое для оседания эритроцитов (обычно 45 мин) при соответствующей температуре и рН. Титром ТГ считают наибольшее разведение сыворотки, тормозящее гемагглютинацию.

Реакция торможения гемагглютинации высокочувствительна и высокоспецифична (исключение составляют тогавирусы). Она позволяет обнаружить только те антитела, которые непосредственно связаны с вирусным гемагглютинином (т. е. с выступающими концами пепломеров большинства суперкапсидных вирусов), а также, возможно, и антитела, способные присоединяться к антигенам, столь близко расположенным к гемагглютинину, что торможение ГА будет происходить из-за стерических препятствий. Такие поверхностные антигены обычно являются типоспецифическими.

Реакция ТГ проста, не требует больших затрат реактивов и времени. Она представляет собой наиболее удобный серологический метод для определения антител к любому вирусу, вызывающему гемагглютинацию.

гемаглютинация вирусов

Выявление вирусов диффузией в геле

Взаимодействие антиген—антитело можно обнаружить с помощью реакции преципитации в полужидком геле. Антиген и антитело вносят в лунки, вырезанные в тонком слое агара, помещенного на предметном стекле, или в чашку Петри. Реагенты диффундируют через агар со скоростью, обратно пропорциональной их молекулярным весам. Там, где антиген и антитело встречаются в оптимальных соотношениях, в агаре образуется четкая линия преципитата. Если в пробе содержится несколько антигенов и соответствующих им антител, как в большинстве неочищенных препаратов вирусов и неадсорбированных антивирусных сывороток, то каждый комплекс антиген—антитело образует дискретную линию преципитации.

Если два качественно идентичных препарата антигена (или антисыворотки) поместить в соседние лунки, то при их диффузии по направлению к общей лунке с антисывороткой (или антигеном), равноотстоящей от обеих лунок, концы соответствующих линий преципитации сольются. Это явление носит название реакции идентичности.

Диффузия в геле является весьма эффективным методом, позволяющим одновременно обнаружить все антитела (или антигены), присутствующие в исследуемом материале. Четкий ответ можно получить на следующий день, а иногда даже через несколько часов. Вместе с тем метод нельзя считать количественным, так как он не дает точных представлений о «титре» неизвестного антитела или антигена. Более того, для образования видимой полосы требуются достаточно высокие концентрации обоих компонентов. Необходимо учитывать, что очищенныз вирусы, как правило, нельзя использовать в качестве антигенов при диффузии в геле, поскольку большая часть вирионов слишком велика, чтобы диффундировать сквозь агар с удовлетворительной скоростью.

Однако грубые препараты обычно содержат значительную часть антигенов вириона в «растворимой» или в мелкокорпускулярной форме, хотя некоторые антитела реагируют только с целыми вирионами и не реагируют с соответствующими белками в изолированном состоянии. Это представляет некоторую техническую трудность, потому что один и тот же специфический антиген, содержащийся в частицах различного размера, может дать несколько линий преципитации. Многие из отмеченных недостатков устранены важным новым усовершенствованием, в результате которого диффузия в геле превращается в более чувствительный, поддающийся количественной оценке метод. Антиген (либо в виде целых вирионов, но лучше в «растворимой» форме) включается в агар; чем ниже концентрация антигена, тем выше чувствительность теста.

Помещенные в лунки антисыворотки диффундируют и образуют преципитат с антигеном. Измеряя диаметр кольца преципитата, мы получаем количественную оценку реакции. Чувствительность метода возрастает, если после отмывания антигена (если он был «растворим») преципитат окрасить тиазиновым красным. Чувствительность метода можно увеличить, пометив антиген радиоактивным 125I. Для регистрации радиоактивности используют метод радиоавтографии или просчитывают вырезанное кольцо агара в сцинтилляционном счетчике.

- Читать далее "Связывание комплемента для выявления вирусов. Техника связывания комплемента"

Оглавление темы "Выявление вирусов":
1. Критерии чистоты вирусных препаратов. Радиоактивные изотопы в изучении вирусов
2. Электронная микроскопия вирусов. Гибридизация вирусов
3. Гибридизация ДНК вирусов. Нуклеиновые кислоты вирусов
4. Диагностика вирусных нуклеиновых кислот. Белки вирусов
5. Белковый состав морфологических субъединиц вирусов. Оболочки и ферменты вирусов
6. Антитела и антигены вирусов. Нейтрализация вирусов
7. Торможение гемаглютинации вирусов. Выявление вирусов диффузией в геле
8. Связывание комплемента для выявления вирусов. Техника связывания комплемента
9. Иммунофлуоресценция вирусов. Виды иммунофлуоресценции вирусов
10. Радиоиммунологические методы выявления вирусов. Техника радиоиммунных методов