Анализ физико-химических свойств возбудителя скрепи убеждает в его резком отличии от всех известных до сих пор инфекционных агентов. Эта необычность свойств, естественно, породила разнообразные предположения о природе возбудителя. В настоящее время существует несколько гипотез о природе агента скрепи, что уже само по себе свидетельствует о том, что ни одна из них не может претендовать на абсолютную обоснованность. Возбудитель скрепи на сегодняшний день отнесен к прионам.

Вирусная гипотеза возбудителя скрепи. Давно и точно установленная инфекционная природа заболевания, малые размеры возбудителя и характер патологического процесса послужили главными поводами для формирования представлений о вирусной природе агента скрепи (Eklund е. а., Field). Казалось, что с точки зрения экспериментальной вирусологии не существует причин, по которым агент скрепи нельзя бы было отнести к вирусам. Действительно, фильтрующийся агент при введении мышам постепенно заражает различные ткани, включая и лимфатическую систему.

По-видимому, достигнув какого-то уровня размножения, вирус прорывается в центральную нервную систему, в которой он вызывает характерные патологоанатомические изменения. Иными словами, агент скрепи ведет себя как классический нейротропный вирус, очень медленно реализующий свое патогенное (патогенетическое) действие (Field).

Большая часть необычных физико-химических свойств возбудителя может быть объяснена в двух аспектах:
1) в литературе можно найти примеры вирусов, каждый из которых обладал бы каким-нибудь одним свойством, характерным для возбудителя скрепи (но не всеми свойствами последнего!);
2) вполне возможно, что агент скрепи приобретает оболочку от клетки-хозяина, что в конечном счете и придает новые свойства такому комплексу (Hunter).

Однако главным возражением против вирусной гипотезы скрепи долгое время оставалась необычайно высокая резистентность агента к ультрафиолетовым лучам. Правда, сторонники вирусной гипотезы пытались объяснить эту особенность агента присутствием в его составе необычно простой нуклеиновой кислоты или исключительно высокой скоростью (или необычностью механизмов) репарационных процессов. Тем не менее главный вирусологический довод был получен в результате анализа поведения штамма U-1 вируса табачной мозаики.

Оказалось, что состоящая из нуклеиновой кислоты сердцевина вируса (core) является на порядок чувствительнее к ультрафиолетовым лучам, чем целый вирион (Kleczkowski, McLaren,). Этот пример свидетельствует о том, что белковая оболочка может обеспечивать защиту нуклоиповой кислоты вируса от инактивирующего действия ультрафиолетовых лучей. Правда, в случае с агентом скрепи предположения подобного же механизма требуют и допущения того, что белковая оболочка этого агента способна защищать нуклеиновую кислоту в 100 раз эффективнее, чем белковая оболочка штамма U-1 вируса табачной мозаики (Hunter).

Гипотеза вироида возбудителя скрепи

Эта точка зрения на природу агента скрепи является как бы производной вирусной гипотезы.

В 1971 г. Diener показал, что вирус веретеновидности клубней картофеля на самом деле представляет собой свободную одноцепочечную реплицирующуюся РНК удивительно малой молекулярной массы, равной примерно 8—9[104 дальтон. Этот вирус был отнесен к новому классу возбудителей, названных вироидами, в состав которых теперь уже включены вирусы низкорослости хризантем (Diener, Lawson) и экзокортиса цитрусовых (Semancik, Weathers).

Diener полагает, что РНК указанных возбудителей являются первыми известными представителями нового класса субвирусных патогенных агентов, которые характеризуются отсутствием покоящейся формы (вириопа). Автор ставит вопрос о том, ограничиваются ли вироиды высшими растениями или они способны поражать (или просто реплицироваться) в организме животных. С этой точки зрения представляется целесообразным предпринять поиски сходных агентов в тех многочисленных случаях, при которых вирусная этиология инфекционного процесса предполагается, однако сам вирус до сих пор еще не выделен (Diener).

Одним из примеров подобного рода может служить агент скрепи. Diener прямо ставит вопрос: «Является ли агент скрепи вироидом?». Автор выносит этот вопрос в заглавия статей (Diener) или их разделов (Diener) и пытается проанализировать собственные и существующие в литературе данные, подчеркивая весьма выраженное сходство в ряде свойств обоих возбудителей: продолжительный инкубационный период; накопление инфекционности в инфицированном хозяине до высоких титров; отсутствие вирусоподобных частиц при электронно-микроскопическом анализе зараженных тканей; отсутствие определяемых антител; высокая резистентность к нагреванию (которая у вироида экзокортиса цитрусовых оказывается даже более высокой); малая молекулярная масса, незначительная инфекционность в растворимой форме в тканевых гомогенатах и др.

В концепции Diener подкупает стремление не только систематизировать свойства, подтверждающие сходство агента скрепи и вироидов, по и, что самое главное, понять и проанализировать те свойства, которые, как кажется, разъединяют этих возбудителей. Автор особо отмечает высокую устойчивость агента скрепи к ультрафиолетовым лучам, нуклеазам и, напротив, повышенную чувствительность к фенолу, хлориду цезия, мочевине и эфиру.

Для определения возможных причин высокой устойчивости агентов типа вироидов к ультрафиолетовым лучам были проведены специальные экспериментальные исследования. С этой целью в первой серии опытов очищенные препараты вируса ве-ретеновидности клубней картофеля (ВВКК) смешивали с очищенным препаратом вируса кольцевой пятнистости табака (ВКНТ) и смесь облучали ультрафиолетовым светом с длиной волны 253,6 нам. Оказалось, что для снижения инфекционности до 10,1 или 0,1% по сравнению с исходной в случае ВВКК требуется в 90 раз большая доза, чем в случае ВКПТ. Автор делает вывод о том, что неизмеримо более высокая устойчивость вироида к ультрафиолетовому свету связана со значительно меньшими размерами его мишени.

С другой стороны, чтобы определить, является ли ВВКК частично защищенным в неочищенных экстрактах от инактивации ультрафиолетовым светом, осветленные экстракты готовили из листьев томата, зараженного ВВКК. После добавления ВКПТ полученную смесь облучали и раздельно определяли инфекционность каждого агента на различных этапах процесса облучения.

В этих условиях, как вылепилось, для снижения уровня инфекционности ВКПТ требовалась доза в 8 раз большая, чем для снижения его активности в очищенном экстракте. Одновременно с этим не было обнаружено заметной инактивации инфекционности ВВКК при облучении в течение 24 ч (8,6х105 эрг/мм2).

Результаты позволили сделать вывод, что в осветленных (но не в очищенных!) экстрактах вирус веретеновидности клубней картофеля эффективно защищен от ипактивирующего действия ультрафиолетовых лучей, в то время как обычные вирусы в подобных условиях оказываются уже инактивированными, хотя данный процесс и протекает с меньшей скоростью. Принимая во внимание подобного рода данные, известная высокая резистентность агента скрепи к ультрафиолетовым лучам, наблюдаемая в мозговых гомогенатах, не обязательно свидетельствует об отсутствии в составе возбудителя нуклеиновой кислоты как генетического материала.

Наиболее существенным аргументом против природы вироида рассматривается высокая чувствительность агента скрепи к фенолу. Недавно была опубликована работа, специально посвященная анализу этого свойства возбудителя скрепи (Ward е. а.). Мозг больных скрепи мышей смешивали с равным объемом ТЕ-буфера, содержавшего меченную по 14С рибосомальную 18S РНК и меченную по 3 6S ДНК из клеток HeLa, которые служили маркерами. После осторожной фенольной экстракции и переосаждения этанолом потери по маркерам составляли 19% для меченой РНК и 15% для меченой ДНК. Анализом смеси в градиенте плотности глицерина исключали возможную деградацию нуклеиновых кислот в процессе обработки.

Для исключения возмояшых функциональных нарушений нуклеиновых кислот материал, содержащий агент скрепи, смешивали с вирусом менго. После фенольиой экстракции инфекционпость вируса менго снижалась более чем в 10⁶ раз. но после повторной фенольиой экстракции одной вирусной РНК или в смеси с материалом, содержащим агент скрепи, инфекционная активность РНК вируса менго не изменялась, хотя полностью снималась РНК-азой. В связи с полной (после фенольной экстракции) инактивацией ннфекционности материала, содержащего агент скрепи, авторы заключают, что этот агент не является ви-роидом.

Подобную категоричность едва ли можно считать правильной, так как все, что известно до сих пор об агенте скрепи, получено при экспериментальном изучении инфицированных мозговых гомогенатов. Вместе с тем не следует забывать, что история изучения вирусов во многом является историей совершенствования методов отделения вирусов от балластных веществ. Поэтому между значимостью данных, полученных с препаратом, например, фракционированным в градиенте плотности веществ, и с препаратом, не подвергавшимся даже минимальной степени очистки, по-видимому, ошибочно было бы ставить знак равенства.

Белковая гипотеза основана на представлении о том, что агент скрепи представляет собой самореплицирующуюся белковую молекулу (Griffiths, Pattison, Jones). Подобная мысль была сформулирована на основании безуспешных попыток обнаружения инфекционных нуклеиновых кислот в инфицированных тканях (Marsh е. а.).
Вместе с тем белковая гипотеза наиболее умозрительная и именно к белкам отнесены прионы.

Гипотеза полисахарида возбудителя скрепи

Представления о полисахаридной природе агента скрепи или его основной части формировались на основании данных об устойчивости агента к ультрафиолетовым лучам и его высокой чувствительности к окисляющему действию перйодата.

Согласно этой гипотезе, агент скрепи представляет собой особый вид полисахарида, способного к самовоспроизведению (Palmer — цит. по В. И. Гаврилову и др., Adams, Caspary). Однако, так же как и белковая, гипотеза полисахарида до сих пор не получила экспериментального подтверждения выделением полисахаридной фракции инфицированных тканей — фракции не содержали инфекционного начала.

Мембранная гипотеза впервые была выдвинута Gibbons и Hunter, которые на основании физико-химических свойств возбудителя сделали вывод об отсутствии в его составе нуклеиновых кислот и предложили в качестве объяснения причины заболевания скрепи представление о способных к репликации структурно измененных клеточных мембран. Надо отметить, что мембранная гипотеза оказалась весьма плодотворной и па протяжении последующих лет, благодаря накопленным фактическим данным, была значительно расширена и детализирована (Hunter).

Первый постулат мембранной гипотезы, заключающийся в том, что активность агента скрепи является интегральной частью клеточной мембраны, вскоре получил многочисленные экспериментальные подтверждения. Действительно, исходя из сформулированного выше представления, становятся понятными все те неудачи, которые сопровождали попытки обнаружения возбудителя во фракциях каких-либо отдельных классов макромолекул — нуклеиновых кислот, белков, полисахаридов. Первый же постулат мембранной гипотезы позволяет представить различия между величиной возбудителя и радиационной мишенью: специфическая активность скрепи обусловлена двухкомпонентной системой, в которой один компонент представляет собой малую молекулу возбудителя скрепи, соответствующую радиационной мишени, в то время как другим компонентом служит мембрана-носитель, облегчающая внедрение молекулярного агента внутрь чувствительной клетки (Hunter).

После формулирования основных положений мембранной гипотезы был получен богатый экспериментальный материал, хорошо подкрепляющий представления о мембранной природе возбудителя. Это прежде всего относится к обнаружению высокой чувствительности агента скрепи к различным растворами детергентам, которые вызывают значительные разрушения мембранных структур (Hunter, Hunter е. а.). Кроме того, было показано, что препараты ядер, лизосом, митохондрий и миелина, выделенные из зараженного агентом скрепи мозга мышей, обладали относительно низкой инфекционной активностью.

В то же время такая активность была неизмеримо более высокой во фракциях, богатых ферментами, которые рассматривают в качестве маркеров клеточных мембран и эндоплазматического ретикулума (Millson е. а.). Наконец, прямо было показано, что инфекционные фильтраты агента скрепи содержат фрагменты мембран, а неинфекционные не содержат их (Kimberlin е. а.).

Все эти данные в совокупности с результатами электронно-оптического анализа инфицированных тканей, свидетельствовавшими о большом количестве измененных мембран в инфицированных тканях (Lampert е. а.), поставили мембранную гипотезу в ряд наиболее хорошо экспериментально обоснованных концепций. Одним из важных положений мембранной гипотезы является представление о существовании в составе мембранной структуры способного к репликации гликопротеида. Интересно, что сами авторы гипотезы были немало удивлены, обнаружив резкие изменения обмена гликопротеида не только в мембранной фракции мозга при скрепи, но и в ядерной и в растворимой фракциях клетки (Hunter е. а., Hunter, Millson, Millson). Предполагается, что дальнейшие эксперименты должны внести ясность и привести к решению одной из четырех возможностей:
1) гликопротеиды могут быть компонентами агента скрепи,
2) могут представлять собой генные продукты нуклеиновой кислоты агента скрепи,
3) могут служить связующими участками для агента скрепи и, наконец,
4) могут представлять собой пролиферацию мембран в ответ на присутствие агента скрепи (Hunter).

Столь широкая постановка вопроса о возможной природе и сущности мембранных структур при скрепи превращает мембранную гипотезу в наиболее активного партнера при анализе рассмотренных выше точек зрения на природу агента скрепи. По-видимому, каждая гипотеза, а вирусная и мембранная в особенности, содержит рациональное зерно, которое может быть использовано в процессе познания этиологического фактора скрепи.

Прекрасной иллюстрацией этому служит концепция «связанного вещества» Adams с соавт., основанная на результатах их многолетних работ. Эти исследователи полагают, что агент скрепи содержит в своем составе очень небольшую дезоксирибонуклеиновую кислоту, окруженную необычно большой оболочкой полисахаридного состава. Однако агент становится инфекционным только после попадания в организм и объединения в структуру с веществом неизвестной природы, находящимся в составе клеточных мембран.

Для проверки высказанных положений в лаборатории Adams было проведено изучение включения 3Н-тимидипа и 14С-глюкозамина в ДНК-полисахаридный комплекс в мозге нормальных и зараженных агентом скрепи мышей. Для этого каждой мыши вводили по 10 мкКи 3Н-тимидина и по 5 мкКи 14С-глюкозамина; мышей забивали, мозг гомогенизировали и определяли включение метки в пострибосомальный осадок и во фракцию мембран.

В пострибосомальном осадке пик специфической активности в материале от зараженных мышей был в 2 раза выше, чем в материале от нормальных мышей. Обработка осадка 6М мочевиной приводила к элиминации 95% материала, поглощающего ультрафиолетовые лучи и содержащего радиоактивность. Экстракция нуклеиновых кислот из таких обработанных мочевиной материалов позволяла обнаружить, что увеличение неспецифической активности связано практически только с ДНК, а не с РНК. С учетом незначительности изменений соотношения 3H/14C после указанной обработки становится очевидным, что полисахарид прочно связан с ДНК. При обработке фракций мембран мочевиной и последующем фракционировании на сефадексе был выделен тот же комплекс, что и при обработке пострибосомального осадка. При этом отмечено, что в обоих случаях отношение 3Н/14С было одинаковым (Adams е. а.).

Авторы считают, что комплекс ДНК—полисахарид интенсивно реплицируется в клетках, пораженных скрепи, и связывается с клеточными мембранами. Вместе с тем отмечают, что данных для отождествления этого комплекса с агентом скрепи все еще недостаточно.

Adams обнаружил, что имеется небольшое увеличение во внеядерном синтезе ДНК, которое может быть связано более прямым путем с репликацией агента скрепи. Эти данные также основаны на исследованиях с мечеными атомами, включая определения очень низких уровней радиоактивности. Вслед за этими данными в лаборатории Hunter был разработан метод экстракции малых количеств связанной с мембраной ДИК. При этом до экстракции было необходимо разрушить ДНК-азу нагреванием, после чего экстрагированную ДНК фракционировали методом электрофореза в полиакриламидном геле. Описанный метод позволил обнаружить в мозге в начале клинической фазы заболевания появление нового связанного с мембраной вида ДНК с молекулярной массой порядка 105, что соответствует величине радиационной мишени возбудителя. Остается выяснить вопрос, обусловливает ли этот вид ДНК передачу биологической активности агента скрепи.

Перечисленные выше примеры не исчерпывают существующих мнений о природе возбудители скрепи. Однако отличие иных представлений от проанализированных выше состоит в том, что они в большей степени умозрительны и дают меньше реальных оснований для конкретной экспериментальной проверки.

К числу подобных взглядов относится мнение Pattison, который считает, что возбудитель скрепи относится к новой, не известной еще пауке группе инфекционных агентов. Д. М. Лшер, Д. К. Гайдушек и К. И. Гиббс полагают, что информация, необходимая для синтеза агента скрепи, по всей вероятности, заложена в геноме всех восприимчивых хозяев и очень мелкие структуры, несущие информацию самого агента (например, нуклеиновая кислота или иные макромолекулы), могут служить дерепрессором этой информации.

Акторы разъясняют и подчеркивают, что возбудитель скрепи обладает вирусоподобной способностью активировать собственный синтез в клетках, которые могут содержать кодоны для синтеза этих активирующих агентов (Gibbs, Gajdusek). И качестве механизмов представляются вероятными интегрированная комплементация или дерепрессирующее действие, которые активируют синтез таких агентов, нормально репрессированных или «выключенных» последовательностей. Не исключено также, что активирующие агенты могут действовать как дерепрессоры, освобождающие частичную или полную генетическую информацию для синтеза других дефектных или полных вирусов, которых могут находить в клетке в результате прошедшей инфекции в более ранних поколениях.

- Читать "Клиника скрепи - проявления"

1. Возбудитель болезни Крейтцфельда — Якоба - структура, особенности приона
2. Клиника болезни Крейтцфельда—Якоба - проявления
3. Патогенез (механизмы развития) болезни Крейтцфельда—Якоба
4. Эпидемиология болезни Крейтцфельда—Якоба - распространенность
5. Скрепи - история изучения, открытия
6. Возбудитель скрепи - структура, особенности приона
7. Теории природы возбудителя скрепи - открытие прионов
8. Клиника скрепи - проявления
9. Патогистология скрепи - морфология
10. Патогенез скрепи - механизмы развития