Советуем для ознакомления:

Вирусология:

Популярные разделы сайта:

Возбудитель скрепи - структура, особенности приона

В 1950 г. Wilson с соавт. обнаружили, что инфекционный агент, вызывающий развитие скрепи, проходит через градоколовые мембраны с диаметром пор 410 нм. Это открытие послужило основанием для отнесения возбудителя скрепи к микроорганизмам.

Впоследствии размеры приона скрепи определяли разные исследователи. В некоторых случаях были получены совершенно неожиданные результаты. Так, Pattison и Sansom и Pattison и Jones на основании изучения диализабельности возбудителя утверждали, что его размеры находятся в пределах 0,4—2,4 нм.

Последующие проверочные определения показали, что столь низкие цифры были обусловлены техническими погрешностями опытов и в настоящее время признано, что размеры вируса скрепи соответствуют 17—27 нм (Haig, Clarke, Gibbs, Gajdusek), а его молекулярная масса не превышает 1,5— 2*105 (Adams). Исследования с фильтрацией в геле дали аналогичные результаты (Kimberlin е. а.).

Изучение свойств агента скрепи с первых же шагов позволило получить поистине сенсационные результаты, анализ которых до сих пор служит предметом оживленных дискуссий и основанием для ряда смелых и оригинальных гипотез.

Так, оказалось, что возбудитель в высушенном состоянии сохраняет жизнеспособность на протяжении 2 лет хранения при температуре 8—12°С (Gardashyan). Более 15 лет назад удалось установить, что даже после 30-минутного кипячения инфицированная ткань сохраняет инфокционность для здоровых овец при их заражении под кожу (Mackay е. а.).

Естественно, что благодаря подобной степени термоустойчивости инфекционпого агента были проведены подробные исследования. На основании опытов было показано, что температура 87,5°С — критическая для агента. При этой температуре происходит быстрая термоинактивация, однако и в этих исследованиях была подтверждена способность возбудителя сохранять некоторую степень инфекционности после кипячения инфицированного материала (Hartley, Zlotnik, Rennie).

Не менее удивительными оказались результаты исследования устойчивости агента к действию ультрафиолетовых лучей и проникающей радиации. Так, облучение суспензии мозга больных скрепи мышей ультрафиолетовыми лучами (254 нм) в дозе 1000 эрг/сек/см2 вызывало снижение инфекционного титра лишь на 1,6 lg (Gajdusek, Gibbs).

Резистентность к действию ультрафиолетовых лучей была проверена в нескольких лабораториях мира, при этом в ряде случаев обнаруживалась даже более высокая устойчивость, а также было выяснено, что резистентность возбудителя к облучению была выше при 250 и 280 нм, нежели при 237 нм (Latarjet о. а.), и превосходила устойчивость вируса трансмиссивной энцефалопатии норок. Отмечено, что дозы, необходимые для инактивации агента скрепи, уреазы и малеиновой дегидразы, весьма близки (Haig е. а.).

Значительная степень инактивации агента скрепи достигалась лишь при использовании необычайно высоких доз ионизирующей радиации, которые свидетельствовали о том, что величина мишени соответствует 1,5х105 дальтон (Alper е. а., Field е. a.).

Репликация приона скрепи

Из приведенных выше примеров ясно, что устойчивость возбудителя к обоим описанным выше физическим агентам намного превосходит таковую у всех известных вирусов. Подобная резистентность сочетается с повышенной устойчивостью и к действию ряда химических агентов.

Так, давно известна высокая устойчивость агента скрепи к формалину (Gordon, Greig). Детальные исследования сохранения инфекционности в кусочках зараженного мозга, которые выдерживали различное время в растворах формалина разной концентрации, показали, что возбудитель устойчив к 20% раствору формалина в течение 18 ч и к 12% — в течение 28 мес.

В разведенных неочищенных мозговых суспензиях агент скрепи стабилен при рН 2,1—7,0; он резистентен к действию пепсина, трипсина, ацетилэтиленамина, ДНК-азе и РНК-азе. Возбудитель слабочувствителен к н-пентанолу (снижение титра, на 0,7 Ig), n-бутанолу и ультразвуку (0,7 Ig) и к одному ультразвуку (0,2 Ig); умеренно чувствителен к эфиру (2,2 Ig), кислому метоксиэтанолу (1,4 Ig) и смеси хлороформа и метанола в соотношении 2 : 1 (1,1 Ig); заметно чувствителен к 2-хлорэтилу (80% снижает титр на 5,0 lg, 50% —на 1,9 Ig) и высокочувствителен к действию периодата (0,01 М), 6—8 М водному раствору мочевины, 90% фенолу (Hunter).

При сравнительном испытании чувствительности к 0,3% спиртовому раствору йода различных инфекционных агентов обнаружено, что при смешивании в отношении 1 : 1 материалов, содержащих классические вирусы, их инфекционная активность полностью разрушалась; в тех же условиях инактивировалось более 99,9% инфекционной активности агента скрепи (Bell е. а.).

Анализируя степепь устойчивости возбудителя скрепи к растворителям жиров (эфир, хлороформ и фторуглерод), Lavelle высказал предположение о возможности существования агента в чувствительной и в нечувствительной к подобным растворителям форме. При этом автор добавлял, что последняя форма, по-видимому, не содержит ощутимого количества липидов. Вместе с тем после удаления из вирусосодержащих препаратов основной массы липидов наблюдают повышение чувствительности агента к действию нагревания, протеолитиче-ских ферментов и 6 М раствора хлорида лития.

Центрифугирование в течение 1 ч при 100 000 g по приводит к снижению инфекционной активности центрифугируемого материала, в то время как после центрифугирования в течение 15 ч агепт скрепи в падосадочной жидкости не обнаруживается (Pattison е. а.).

Фракционирование хорошо деспергированного инфекционного материала в градиенте плотности сахарозы или тартрата калия позволяет обнаружить основной пик инфекционной активности возбудителя в зоне расположения клеточных мембран, плотность которой соответствует 1,16 г/мл (Kimberlin е. а.). Однако при фракционировании инфекционного материала в градиенте плотности хлорида цезия биологическая активность оказывается значительно более широко распространенной и при этом высокая степень инфекционности обнаруживается в зоне с плотностью 1,32 г/мл (Gibbs е. а.).

Известно, что овцы были первыми хозяевами, чувствительными к агенту скрепи. В 1974 г. Benion сообщил о случаях заболевания скрепи среди коз, а в 1939 г. Cuille и Chille вызывали скрепи у коз после их экспериментального заражения материалом, полученным от больных овец. Однако и те и другие животные значительно отличаются по своей чувствительности к возбудителю. Так, козы обладают 100% чувствительностью к агенту скрепи, в то время как у овец она значительно варьирует. Например, овцы породы «хердвик» отличаются наивысшей чувствительностью — 78%, «дерби» — 35%, шотландские черномордые — 18%, «суффолк» — 12%, шропширские — 5% и дорссеты —0% (Pattison, 1972).

Хотя инкубационный период у коз длительный и непостоянный, следует отметить, что благодаря их использованию удалось разделить возбудитель на два штамма, вызывающие разные клинические симптомы заболевания («сонливые» и «чешущиеся» козы; Pattison, Millson).

прионы

Скрепи удалось также передать крысам, норкам, рыжим полевкам, золотистым и китайским хомякам, а недавно и обезьянам циномольгус и белкообразным (Gibbs, Gajdusek). При этом иногда отмечают большую продолжительность инкубационного периода. Так, например, у обезьян циномольгус он равнялся 5,5 годам, хотя у белкообразных — всего 18—20 мес. Между тем шимпанзе, зараженные мозгом больных скрепи овец, коз и мышей, оставались здоровыми на протяжении 5-летнего периода наблюдения.
Возбудитель успешно размножается в условиях клеточной культуры, приготовленной из мозга больных скрепи животных.

Такие клетки, содержащие возбудитель, прошли более 150 пассажей, однако до сих пор не удалось вызвать репродукцию агента заражением культур интактных клеток как первично трипсинизированных, так и перевиваемых линий. Подчеркивается, что персистенция агента скрепи в клетках сопровождается повышением их скорости пролиферации, при этом создается впечатление синхронного размножения возбудителя с процессом клеточного размножения. Это позволяет предполагать, что агент является интегральной частью зараженной клетки, напоминая интегрированный провирус (Clarke, Haig). В таких клеточных культурах не обнаружено признаков цитопатогенного эффекта и не выявлено вирионов, распознаваемых с помощью электронного микроскопа (Gibbs, Gajdusek).

Учитывая эти особенности инфицированных агентом скрепи культур, следует признать целесообразными попытки заражения интактных клеточных культур с использованием техники гетерокарионов, тем более, что в инфицированных культурах обнаруживают значительные количества возбудителя. Так, например, клеточная линия, сформированная из мозговой ткани больных скрепи мышей, прошла более 100 пассажей, во время которых инфекционный титр колебался от 101,1 до 103,5 в 0,05 мл исследуемого материала (Haig).

Цитопролиферативная активность агента скрепи выявлялась не только в культурах инфицированных клеток, но и в органных культурах мозговой ткани животных, больных скрепи.

Исследования в динамике позволили установить, что увеличение числа клеток происходит в культурах мозговой ткани, взятой за 15 дней до появления гистопатологических изменений и за 60 дней до появления симптомов заболевания. К 150-му дню число клеток в культурах, полученных из инфицированного агентом скрепи мозга, было в 5 раз выше, чем в контрольных культурах (Buening, Gustafson).

Попытки обнаружения возбудителя с помощью электронного микроскопа, впервые предпринятые около 10 лет назад, позволили обнаружить в коре головного мозга зараженных мышей внутри разбухших отростков нейронов скопления частиц и палочковидные образования диаметром 32—36 нм с полупрозрачными центрами и толщиной стенки 9,5 нм (David-Ferreira е. а., Lampert е. а.). Сходные структуры были найдены внутри вакуолей нейронов в мозге зараженных скрепи овец.

В нейронах инфицированных скрепи крыс Field и Narang описали маленькие, не обнаруживаемые в световом микроскопе включения, которые состоят из комплексов сложенных мембран. Как в нейронах, так и в осевых цилиндрах найдены неограниченные мембраной скопления палочковидных или сигарообразных структур длиной около 60 нм и шириной менее 20 нм. Во многих частицах видна плотная удлиненная сердцевина диаметром около 4 нм, которая, по мнению авторов, может представлять собой инфекционную нуклеиновую кислоту. Размер описанных структур соответствует размерам агента скрепи.

Недавно Narang показал в нейронах, пресинаптических окончаниях и осевых цилиндрах больных овец присутствие двух типов вирусоподобных частиц. Частицы первого типа длиной около 60 нм и толщиной менее 20 нм имели сердцевину диаметром около 4 нм и не были ограничены мембраной. Частицы второго типа имели длину около 75 нм, диаметр 15— 26 нм. На продольных срезах сердцевина таких частиц диаметром около 6 нм занимает только половину длины частицы. Частицы этого типа окружены мембраной толщиной 15 нм и, как предполагают, образуются почкованием от клеточной мембраны или мембраны вакуолей.

Автор высказывает также мысль о том, что обнаруженные два типа вирусоподобных частиц, возможно, соответствуют незрелым и зрелым их формам.

Тот же автор, проводя электронно-микроскопическое исследование мозга зараженных скрепи мышей и крыс, добавлял в стандартные фиксирующие растворы 0,05% рутения красного и 1% нитрата лантана. В препаратах мозга были обнаружены плотные вирусоподобные частицы шириной 22—24 нм, представляющие собой нитевидные трубочки с хорошо прослеживающимся в центре отверстием диаметром 4—5 нм. Высказывается предположение, что сердцевины таких частиц состоят из нуклеиновых кислот, а поверхностные структуры — из кислых полисахаридов (Narang).

- Читать "Теории природы возбудителя скрепи - открытие прионов"

Оглавление темы "Прионные инфекции":
  1. Возбудитель болезни Крейтцфельда — Якоба - структура, особенности приона
  2. Клиника болезни Крейтцфельда—Якоба - проявления
  3. Патогенез (механизмы развития) болезни Крейтцфельда—Якоба
  4. Эпидемиология болезни Крейтцфельда—Якоба - распространенность
  5. Скрепи - история изучения, открытия
  6. Возбудитель скрепи - структура, особенности приона
  7. Теории природы возбудителя скрепи - открытие прионов
  8. Клиника скрепи - проявления
  9. Патогистология скрепи - морфология
  10. Патогенез скрепи - механизмы развития