Лабораторная диагностика хламидий

Для постановки этиологического диагноза хламидийных инфекций используют следующие методы:

а) Цитологические (морфологические) методы:

1. Цитологический (морфологический) метод, основанный на микроскопическом исследовании клинического материала, в основном соскобов пораженных тканей, в световом микроскопе. Для определения морфологических структур в нативных препаратах пользуются различными видами красителей. Этот метод прост в исполнении, не требует использования дефицитных и дорогостоящих реактивов. Однако низкая чувствительность (30-60% положительных результатов при конъюнктивитах и 25-30% — при урогенитальном хламидиозе) ограничивает его применение.

Использование этого метода показано только при острых формах инфекции, в остальных случаях в силу низкой чувствительности и недостаточной специфичности он применяется крайне редко.

2. Метод прямой иммунофлуоресценции (ГШФ) при помощи люминесцентного микроскопа. Цитологическое исследование клинических препаратов с применением моноклональных антител является простым и быстрым методом диагностики. Его постановка занимает менее 1 ч. Однако от сотрудника, занимающегося постановкой и учетом результатов реакции ПИФ, требуется тщательный и квалифицированный просмотр препарата. ПИФ позволяет выявить глазную инфекцию у взрослых в 85% случаев.

Ложноотрицательные результаты часто связаны с малым количеством клеток в пробе, ложноположительные — возможны при наличии в образце нежизнеспособных хламидий, а также других бактерий, имеющих антигены, перекрестно реагирующие с антигенами хламидий. Преимущества метода — быстрота при высокой точности, непосредственное определение возбудителя в объекте исследования, возможность оценить неспецифическое свечение. К недостаткам метода можно отнести субъективную интерпретацию результатов и трудности обработки большого количества образцов.

Метод ПИФ представляет собой альтернативу методу культуры клеток при обследовании популяций с высоким уровнем инфицированности, особенно в быстрой диагностике окулогенитальных инфекций взрослых и неонатальных и инфекций, поскольку позволяет сразу же начать лечение.

Диагностические наборы, содержащие моноклональные антитела для ПИФ: ХламоноСкрин и ХламоноСкрин-2 («Ниармедик Плюс», Россия), Chlamyset Antigen («Orion Diagnostics», Finland), DFA Micro Track («Syva», USA), Chlamydia Direct IF («bioMerieux»).

3. Иммуноферментный анализ (ИФА) — цитологическое исследование клинических препаратов с применением ферментов, ковалентно связанных с одним из компонентов образующегося иммунного комплекса. Чувствительность ИФА колеблется в пределах 80-96% (при уретритах), при бессимптомном носительстве инфекции у мужчин снижается до 44-50%. У женщин эти показатели составляют соответственно 88-100% и 40%. Низкая чувствительность при бессимптомном носительстве ограничивает его применение для выявления данной формы хламидиоза.

Бесспорно, оправдано применение ИФА для диагностики конъюнктивитов, в этом случае чувствительность и специфичность метода составляет 93-98%. Возможные ложноположительные и ложноотрицательные результаты обусловлены теми же причинами, что и при использовании ПИФ. Широкое распространение аппаратов для считывания результатов позволяет использовать ИФА для анализа большого числа образцов одновременно.

Среди производимых наборов наиболее широко применяются Chlamydiasyme Diagbnostic Kit («Abbott Labs»,USA), Syva Microtrak E1A («Syva», USA), 1DEIA III («Dako Diagnostics Ltd»), Surecell Chlamydia Test Kit («Kodak Clinical Prod.», USA), Chlamydia Ag EIA («Labsystems, Finland»).

б) Культуральный метод. Метод диагностического выделения хламидий в культуре клеток McCoy и других линий клеток, чувствительных к хламидиям, считается золотым стандартом в связи с высокой специфичностью (до 100%). Высокий процент ассоциированных с хламидиями бактериальных и грибковых инфекций создает дополнительные трудности в применении данного метода. Получение отрицательных результатов в методе культивирования хламидий в культуре клеток может зависеть от малого количества ЭТ в пробе.

Несмотря на это, метод выделения хламидий в культуре клеток остается специфичным и доказательным методом диагностики, позволяющим обнаруживать жизнеспособный возбудитель. Положительный результат считается достоверным критерием наличия хламидийной инфекции. Однако этот метод требует дорогостоящего оборудования, высокой технической подготовки исполнителей, особого режима работы с возбудителем и условий транспортировки и хранения материала, позволяющих сохранить жизнеспособность микроорганизмов.

в) Серологические методы: реакция непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ) и иммуноферментный анализ (ИФА). Серологические методы, основанные на выявлении титров антител в сыворотке крови и других биологических жидкостях, в диагностике хламидиоза являются вспомогательными. Чаще всего, в силу наибольшей информативности, серологические методы применяются в диагностике орнитоза, респираторного хламидиоза, на ранних стадиях (2-4-я неделя) венерической лимфогранулемы и в тех случаях, когда хламидии локализуются в тканях, не доступных для получения диагностического материала, например, при восходящих инфекциях органов малого таза. Выявление диагностических титров антител в случаях бессимптомного течения инфекции и при тяжелых воспалительных процессах является основанием для дальнейшего обследования пациента при помощи прямых методов диагностики.

Дополнительная серологическая диагностика позволяет избежать ложноотрицательных результатов при диагностике хламидийной инфекции в культуре клеток. При оценке диагностической эффективности серологического исследования следует учитывать возможность перекрестных реакций С. trachomatis, С. pneumoniae, С. psittaci.

В настоящее время нет отечественных коммерческих тест-систем для определения антител в РНИФ.

Диагностические иммуноферментные тест-системы для определения антител: IPAzyme Chlamydia («Savyon Diagnostics Ltd», Israel). ImmunoComb Chlamydia («Orgenics», Israel), Chlamydia trachomatis IgG LIA («Labsystems», Finland), Hitazyme («Hitachi Chemical Co», Japan), Sero Ipalisa («Savyon Diagnostics, Ltd», Israel) и др.

г) Молекулярные методы. Среди молекулярных методов диагностики хламидиозов наиболее широко используются амплификационные методы. Благодаря высокой чувствительности и специфичности как при наличии симптоматики, так и в случае бессимптомного течения инфекции у мужчин и женщин они позволяют выявлять на 1/3 больше случаев, чем при использовании остальных методов. К достоинствам амплификационных методов относятся:

- чувствительность выявления возбудителя при анализе образцов, полученных как инвазивным, так и неинвазивным способом;

- возможность выявления /(НК или РНК хламидий с высокой чувствительностью в нестерильных образцах (моча, вагинальные соскобы), содержащих посторонние микроорганизмы;

- выявление минимальных количеств хламидий при бессимптомном носительстве их у половых партнеров, также не имеющих признаков воспаления;

- возможность проведения скрининговых исследований при анализе самостоятельно полученных вульвовагинальных образцов;

- использование образцов мочи при обследовании пациентов групп риска: военнослужащих, учащихся, беременных.

Одним из наиболее широко используемых амплификационных методов является полимеразная цепная реакция (ПЦР). Она представляет собой многократно повторяющиеся циклы синтеза (амплификацию) специфической области ДНК-мишени в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы, дезоксирибонуклеотидтрифосфатов, соответствующего солевого буфера и олигонуклеотидных затравок — праймеров, которые определяют границы амплифицируемого участка.

Каждый цикл состоит из 3 стадий с различными температурными режимами. В первой стадии при +94°С происходит разделение цепей искомых ДНК, затем при +56°С-63°С — присоединение (отжиг) праймеров к комплементарным последовательностям на ДНК-мишени, далее при температуре +72°С — синтез новых цепей ДНК путем достраивания праймеров в направлении 5’-3’. В каждом цикле происходит удвоение числа копий амплифицируемого участка, что позволяет за 25-40 циклов наработать фрагмент ДНК, ограниченный парой выбранных праймеров, в количестве, достаточном для ее выявления при помощи электрофореза или другими способами.

По сравнению с другими используемыми в клинической практике тестами ПЦР-диагностика обладает рядом преимуществ:
- строгой специфичностью, обусловленной выбором специфических для данного микроорганизма праймеров;
- высокой чувствительностью, позволяющей диагностировать не только острые, но и хронические инфекции;
- быстротой постановки теста — в течение 4-5 ч;
- возможностью одновременного выявления нескольких микроорганизмов в одной пробе, при этом на чувствительность выявления не влияет присутствие посторонней флоры;
- использованием универсального оборудования и методики для проведения анализа на разные возбудители инфекционных заболеваний.

При выполнении ПЦР необходимо строго соблюдать протокол исследования, указанный в инструкции к конкретному ПЦР-набору конкретного производителя. В общих чертах в постановке ПЦР можно выделить три основных этапа: 1) выделение ДНК; 2) амплификация специфических фрагментов ДНК; 3) выявление продуктов амплификации.

д) Методы экспресс-диагностики. В основу методов положены иммунохроматография и фермент-специфическая реакция. Использование наборов различных форм для экспресс-диагностики хламидийной инфекции позволяет визуально проводить учет результатов через 10-15 мин. Однако чувствительность этих методов невысока — 10-20%. Эти наборы могут применяться только для скрининговых исследований.

Изложенные выше данные позволяют сделать следующее заключение: лабораторная диагностика хламидиоза основывается на прямом выявлении возбудителя, его антигенов и ДНК. Серологические методы исследования, направленные на определение специфических антител в сыворотке крови и других биологических жидкостях, следует считать вспомогательными.

Ни один из современных методов диагностики хламидийной инфекции не обеспечивает выявление возбудителя в 100% случаев. Поэтому лабораторная диагностика хламидиозов должна основываться на сочетании не менее двух методов прямого выявления возбудителя, одним из которых является ПЦР. В некоторых случаях, при орнитозе, респираторном хламидиозе и хламидиозе, связанном с восходящей инфекцией малого таза, возможно применение сочетания прямого и непрямого (выявление антител) методов для постановки диагноза.

Ниже приводятся рекомендации по выбору метода исследования для различных клинических образцов в соответствии с рекомендациями ВОЗ.

Соскобы со стенок цервикального канала и уретры (у мужчин).

Показания для исследования: скрининговые исследования, эндоцервициты, уретриты (у мужчин), воспалительные заболевания брюшины, бартолиниты, эпидиди-мит, перигепатит, проктит, реактивный артрит, конъюнктивит.

Методы исследования:
— амплификационные тесты обеспечивают высокую чувствительность;
— выявление антигена (ПИФ, ИФА) — при отсутствии амплификационных тестов или из-за их высокой стоимости;
— подтверждающий тест рекомендован после получения положительного результата при скрининговом исследовании в группах с низким уровнем инфицированности или у больных с противопоказаниями к лечению.

Образцы мочи.

Показания для исследования: для женщин — скрининговые исследования или обследование, для мужчин — скриниговые исследования.

Методы исследования:
— амплификационные тесты обеспечивают высокую чувствительность (другие тесты не пригодны из-за низкой чувствительности или присутствия ингибиторов при культивировании);
— подтверждающий тест рекомендован после получения положительного результата при скрининговом исследовании в группах с низким уровнем инфицированности или у больных с противопоказаниями к лечению.

Соскобы с задней стенки глотки или с конъюнктивы.

Показания для исследования: пневмония и конъюнктивиты у новорожденных, сексуальное насилие.

Методы исследования:
— культуральный метод обеспечивает строгую специфичность и доказательность инфицирования (в случае сексуального насилия);
— методы выявления антигена (ПИФ, ИФА);
— амплификационные тесты.

- Читать далее "Приготовление и окраска препаратов для цитологического исследования на хламидии"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 12.2.2020