Кворум сенсинг (QS) как способ общения бактерий
На протяжении многих десятилетий микробиологи изучали бактерии, выращенные на жидких средах, причем основным критерием при выборе микроорганизма для исследования его физиологии и генетики являлась способность этого микроорганизма расти в виде суспендированной гомогенной культуры. Существовало общепринятое представление, что и в природных условиях бактерии обитают как свободно плавающие (планктонные) клетки, например, в поверхностных слоях морских или речных вод. Все наши знания о росте, метаболизме, адаптационных способностях, физиологии и генетике бактерий были получены при изучении таких планктонных культур бактерий, и накопленная обширная информация позволила получить представление об основных молекулярных механизмах многих жизненно важных процессов, происходящих в их клетках.
Тот факт, что бактерии способны образовывать сложные бактериальные сообщества, играющие важную роль в природе, микробиологам был известен давно, еще со времен Левенгука. Но то, что более 99% бактерий существуют в природных экосистемах не в виде свободно плавающих клеток, а в виде специфически организованных прикрепленных к субстрату биопленок стало известно лишь в последнее десятилетие минувшего века благодаря развитию и применению новых микробиологических и молекулярно-биологических методов исследования. Прогрессу в изучении феномена биопленок способствовало совершенствование техники микроскопирования и особенно применение конфокального сканирующего лазерного микроскопа, позволившего проводить изучение ультраструктуры живых биопленок, а также исследования, связанные с определением экспрессии генов, ответственных за различные стадии развития биопленок и их регуляцию при переходе от планктонного образа жизни к биопленочному.
Расширить и углубить исследования по идентификации генов, контролирующих те или иные процессы в бактериальных клетках, в том числе и образование биопленок, позволили работы по расшифровке нуклеотидных последовательностей геномов ряда патогенных бактерий.
Образование биопленок и их функционирование — пример сложного социального поведения бактерий, регулируемого и управляемого не только сигналами из окружающей среды, но и межклеточными связями.
В последние годы расшифровано и описано явление межклеточного общения бактерий, получившее название «quorum sensing» («кворум сенсинг», или «чувство кворума», QS). Оно связано с глубокими изменениями в метаболизме бактериальных клеток при достижении ими определенной критической плотности (количества клеток на 1 мл среды).
Межклеточные общения типа QS и образование биопленок играют ключевую роль во взаимодействии бактерий с высшими организмами, животными и растениями, как при симбиозе, так и при патогенезе, и, следовательно, определяют инфекционные процессы и развитие болезней. Рассмотрение этих явлений составляет предмет данной статьи.
а) Открытие феномена QS у бактерий. Достижения в области микробиологии в последние два десятилетия показали, что бактерии для своего выживания так же, как и люди, широко используют преимущества, которые дает коллективное поведение. Бактериальный «язык» общения, как выяснилось по мере вовлечения в круг изучаемых бактерий все большего числа видов, чрезвычайно богат и обеспечивается различными низкомолекулярными химическими соединениями, разнообразие которых вполне сравнимо с бытовым словарным запасом человека.
Феномен коллективного поведения бактерий, или «чувство кворума», был впервые обнаружен и описан примерно 25 лет назад при изучении явления биолюминесценции у морской бактерии Vibrio fisheri. При добавлении свободной от бактерий надосадочной жидкости, взятой от культуры люминесцирующих бактерий, достигших высокой множественности, удалось получить эффект люминесценции у бактерий, имеющих низкую плотность, при которой в обычных условиях выращивания свечения еще не наблюдается. При выяснении природы такого эффекта было установлено, что свечение бактерий, обусловливаемое продуктами генов биолюминесценции, осуществляется лишь при достижении определенной плотности (кворума) популяции и контролируется сигнальными молекулами, продуцируемыми самими бактериями и работающими по принципу автоиндукторов (АИ).
Биолюминесценция может начаться только после накопления в культуре молекул АИ до определенного порогового уровня, который достигается лишь при наличии высокой плотности бактерий (>107 КОЕ/мл). После того, как были выделены молекулы АИ, удалось исследовать их структуру. Первый известный АИ оказался принадлежащим к группе ацил-гомосерин лактонов (AHL) — 3-оксо-гексаноил-гомосерин лактоном (3-oxo-C6-HSL), свободно диффундирующим как из бактериальных клеток в окружающую среду, так и обратно. Феномен регуляции работы определенных бактериальных генов в зависимости от плотности клеточной популяции на основе принципа автоиндукции получил название «чувство кворума». Зависимая от плотности клеточной популяции автоиндукция специфических бактериальных генов осуществляется при помощи двух регуляторных белков: 1) белка LuxI, представляющего собой ацил-HSL синтазу, участвующую в биосинтезе сигнальных молекул АИ (N-ацил-гомосерин лактонов), и 2) белка LuxR, являющегося активатором, способным связываться с молекулами АИ и в таком виде активировать транскрипцию оперонов и генов, контролируемых системой QS. Наряду с системой LuxI/LuxR у V.fisheri обнаружена вторая система QS AinS/AinR, которая также участвует в регуляции генов люминесценции. Белок AinS участвует в биосинтезе другого АИ — N-октаноил-L-гомосерина. Он гомологичен белку LuxM V.harvey, второй также хорошо изученной биолюминесцирующей бактерии.
Как стало теперь известно, по типу QS, помимо биолюминесценции регулируется широкий спектр физиологических процессов, включая синтез детерминант вирулентности у патогенных бактерий, перенос конъюгативных плазмид, синтез антибиотиков, образование биопленок и даже процесс репликации у Е. coli.
У разных представителей грамотрицательных бактерий сигнальные молекулы АИ являются N-ацил-L-гомосерин лактонами — родственными соединениями, отличающимися по составу и длине ацильных (СН2) групп (от 4 до 14). Они синтезируются в клетках бактерий под контролем ацилгомосеринсинтаз, называемых обычно LuxI-подобными (по названию белка LuxI системы QS у V.fisheri). Несмотря на большое сходство LuxI-подобных белков у каждого вида бактерий синтезируется преимущественно один вид автоиндуктора.
У грамположительных бактерий в качестве молекул, регулирующих социальное поведение, чаще всего выступают пептиды или модифицированные пептиды. Обычно АИ, синтезируемые различными видами бактерий, специфически взаимодействуют с клетками бактерий своего вида. Недавно был обнаружен автоиндуктор АИ-2, образуемый большим количеством как грамотрицательных, так и грамположительных бактерий, что дало возможность предположить, что он участвует не только во внутривидовой, но и в межвидовой коммуникации бактерий. По своей структуре этот АИ не похож ни на один из ранее описанных АИ; он является фуранозилдиэфиром бора. Пока неизвестно, каким образом он функционирует.
Сенсорные молекулы грамотрицательных бактерий, преобразующие внешний сигнал АИ в транскрипционный или поведенческий ответ клетки, чаще всего являются гистидин киназами, локализованными в цитоплазматической мембране. По аналогии с LuxI они являются LuxR-подобными, так как имеют высокую степень сходства, хотя у каждого вида бактерий названы по-разному. LuxR-подобные белки ответственны за связывание своего «родного» АИ, присоединение к промотору специфичного гена-мишени и активацию его транскрипции.
б) Роль системы QS в регуляции генов вирулентности у патогенных бактерий. Связь между явлением QS и вирулентностью установлена у нескольких патогенных бактерий, использующих системы LuxI/LuxR во время колонизации растений или животных. Недавно появился ряд работ, в которых показано участие регуляторных систем QS в контроле экспрессии генов вирулентности у холерного вибриона, у бактерий, относящихся к комплексу Burkholderia, энтеропатогенных и энтерогеморрагических Escherichia coli, у сальмонелл. Однако наиболее хорошо системы QS изучены у Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus, и поэтому механизм регуляции генов вирулентности при помощи этих систем будет подробно рассмотрен на примере Р. aeruginosa для грамотрицательных и на примере Staphylococcus aureus для грамположительных бактерий.
в) Система QS у Р. aeruginosa. У Р. aeruginosa имеется сложная система регуляции экспрессии генов вирулентности. Эта бактерия обладает по крайней мере двумя системами, работающими по принципу QS — LasI/LasR и RhlI/RhlR, которые работают в тандеме, осуществляя контроль деятельности различных генов. Каждая система QS индуцирует и отвечает на специфический для нее АИ: под действием LasI синтезируется 3-оксо-додеканоил-HSL (3-oxo-C12-HSL), a RhlI ответственна за образование бутирил-HSL (C4-HSL). Методом инсерционного мутагенеза у P.aeruginosa идентифицировано более 40 генов, регулируемых на основе QS. Экспрессия этих генов увеличивается в 5 и более раз в присутствии АИ. Регуляция этих генов при помощи систем LasI/LasR и Rhll/RhlR осуществляется следующим образом. Белок LasI участвует в биосинтезе сигнальных молекул (АИ1), N-(3-оксо-додеканоил)-гомосерин лактонов, a Rhll белок синтезирует молекулы АИ2, N-(бутирил)-гомосерин лактонов.
Молекулы АИ свободно диффундируют из клеток в окружающую среду и обратно. При достижении критического порогового уровня концентрации АИ1 в клетках происходит связывание сенсорного белка LasR с АИ1. Этот комплекс способен присоединяться к промоторам различных генов, кодирующих синтез многих секретируемых факторов вирулентности, ответственных за повреждения тканей организма хозяина, и стимулировать их транскрипцию. К ним относятся ген lasВ, кодирующий эластазу, ген lasA — протеазу, ген toxA — экзотоксин А, ген aprА — щелочную фосфатазу, а также гены ряда других факторов патогенности. Наряду с генами вирулентности этот комплекс индуцирует транскрипцию гена rhlR, инициируя таким образом работу второй системы QS. RhlR связывается с соответствующим ему АИ2, активирует дополнительную транскрипцию ряда LasR-регулируемых генов, а также включает работу нового набора генов, ответственных за синтез вторичных метаболитов, генов синтеза антибиотика тиоцианина, генов синтеза пилей IY типа, инициирующих образование биопленок. Автоиндуктор системы Las препятствует связыванию АИ2 системы Rhl с сенсорным белком RhlR. Благодаря этому обеспечивается последовательность в инициации каскадов двух регуляторных систем и определенный порядок проявления активности контролируемых этими системами генов.
Совсем недавно при анализе полной нуклеотидной последовательности генома P.aeruginosa идентифицирован ген третьего гомолога LuxR-белка, получившего название QscR, который обладает способностью подавлять продукцию LasI-зависимого АИ.
Кроме того, получены данные, показывающие, что в системах QS Р. aeruginosa участвует еще один АИ, не принадлежащий к классу гомосеринлактонов, 2-гептил-3-гидрокси-4-квинолон. Он получил название PQS. Вместе с системами Las и Rhl этот АИ осуществляет контроль экспрессии эластазы, LasB. Экспрессия PQS контролируется активированным белком LasR (LasR-АИ), а сам PQS, в свою очередь, индуцирует транскрипцию гена rhlI. Эти данные указывают на существование дополнительной связи между системами Las и Rhl. PQS инициирует Rhl-каскад, активирует образование RhlI-зависимого АИ только после активации LasI/LasR системы. Образующаяся иерархическая сеть обеспечивает точность времени проявления активности каждого из контролируемых системами QS генов Р. aeruginosa. Такой генетический механизм позволяет патогенным бактериям рационально реализовать свой болезнетворный потенциал. Бактерии не атакуют эукариотическую клетку хозяина, не синтезируют факторы патогенности до тех пор, пока нет полной уверенности в успехе. Данный момент определяется системой QS, которая включает гены факторов патогенности только после достижения бактериями определенной плотности, при которой синтезирующееся количество факторов патогенности гарантирует успешное развитие инфекционного процесса.
г) Система QS у грамположительных бактерий. Выше уже указывалось, что системы QS обнаружены также у грамположительных бактерий и они используются бактериями при регуляции экспрессии генов, кодирующих разные признаки, например, спорообразование у Bacillus subtilis, компетентность у Streptococcus pneumoniae и Bacillus subtilis, конъюгацию у Enterococcus faecalis, вирулентность у Staphylococcus aureus. Обычно грамположительные бактерии используют в качестве сигнальных молекул небольшие пептиды, образующиеся в результате разрезания синтезированного ранее предшественника.
Работа механизма QS у грамположительных бактерий включает несколько ступеней. Вначале синтезируется предшественник сигнального пептида, который затем разрезается с выделением процессированного сигнального пептида. Обычно пептид транспортируется из клетки при помощи белкового комплекса, АВС-транспортера. При достижении определенного уровня внеклеточной концентрации пептида фермент гистидинкиназа двухкомпонентной сигнальной системы реагирует на его присутствие, объединяется с ним, и образовавшийся комплекс ги-стидинкиназа — пептид инициирует серию событий фосфорилирования, включая сам фермент и родственный регуляторный белок в области консервативного остатка аспарагиновой кислоты. В результате происходит активация белка регулятора, связывание его с ДНК и активация транскрипции генов-мишеней.
Наиболее хорошо изученной является регуляция при помощи системы QS генов вирулентности у Staphylococcus aureus. В этом случае экспрессию факторов патогенности регулируют молекулы РНК, получившие название РНКШ, и оперон agrBDCA, кодирующий компоненты пептидной системы QS, которые частично ответственны и за регуляцию уровня синтеза РНК. Ген agrD кодирует предшественник пептида AgrD из 46 аминокислотных остатков, который процессируется до конечного октопептида, выполняющего роль автоиндуктора (ЛИП). Гены agrC и agrA кодируют фермент гистидинкиназу и белок-регулятор, соответственно. АИП взаимодействует с киназой на мембране, этот комплекс активирует регулятор AgrA, который индуцирует транскрипцию как оперона agrBDCA, так и гена, ответственного за образование РНКIII. Различные штаммы S.aureus могут быть отнесены к разным группам, варьирующим по структуре АИП. Вариабельность определяет специфичность АИП при взаимодействии с определенной сенсорной киназой. АИП, принадлежащий к определенной группе штаммов стафилококков, специфически подавляет систему регуляции QS в других группах S.aureus. Это позволяет проникшему и первым установившему QS-контроль штамму быть вне конкуренции по отношению к вторично инфицирующим штаммам стафилококков.
В то же время стимуляция экспрессии agr оперона сильно зависит от присутствия в среде АИП клеток родственного штамма, являющегося членом той же группы, что и инфицирующий штамм.
- Читать далее "Биопленки как способ существования бактерий в окружающей среде и в организме"
Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 8.11.2019