Световая микроскопия. Устройство микроскопа

Для обнаружения и исследования микроорганизмов пользуются микроскопами (micros — малый + scopein —рассматривать, наблюдать). Световые микроскопы предназначены для изучения микроорганизмов и других объектов размером не менее 0,2 мкм, а электронные — для изучения более мелких объектов (структуры микроорганизмов и тканей). В медико-биологических исследованиях, помимо обычной световой микроскопии, применяются фазово-контрастная, интерференционная, люминесцентная, поляризационная, стереоскопическая, инфракрасная микроскопия и др.

Для световой микроскопии биологические объекты обычно окрашивают, предварительно приготовив фиксированные препараты. Для исследования живых и неокрашенных биологических препаратов используют фазово-контрастную и темнопольную микроскопию.

Световые микроскопы подразделяются на студенческие, рабочие, лабораторные и исследовательские, различающиеся по конструкции и комплектации оптикой. Отечественные микроскопы (Виолам, Бимам, Микмед) имеют обозначения, указывающие, к какой группе они относятся (С —студенческие, Р —рабочие, Л — лабораторные, И — исследовательские;), комплектация обозначается цифрой.

Устройство микроскопа. Микроскоп состоит из механической и оптической частей.

1. Механическая часть включает штатив (состоит из основания и тубусодержателя), тубус с револьвером для крепления объективов, предметный столик для препарата, а также приспособления для крепления конденсора и светофильтров. В штатив встроены механизмы для грубого (макровинт) и тонкого (микровинт) перемещения предметного столика или тубусодержателя. Механическая часть обеспечивает крепление и движение оптической части микроскопа.

2. Оптическая часть микроскопа представлена объективами, окулярами и конденсором. В осветительную систему входят расположенный под предметным столиком конденсор, зеркало, с одной стороны плоское, а с другой — вогнутое, а также осветитель. Объективы ввинчиваются в револьвер, а соответствующий окуляр, через который ведется наблюдение, устанавливается с противоположной стороны тубуса. Различают монокулярный (имеющий один окуляр) и бинокулярный (имеющий два одинаковых окуляра) тубусы.

3. Объектив — основной оптический элемент микроскопа. Он «строит» обратное (перевернутое) изображение объекта с определенным увеличением. Затем это изображение дополнительно увеличивается при рассматривании его через окуляр, который аналогично обычной лупе дает уйеличенное мнимое изображение. Увеличение микроскопа ориентировочно можно определить, умножив увеличение объектива на увеличение окуляра. Однако помимо увеличения требуется четкость изображения, которая определяется разрешающей способностью микроскопа, т.е. возможностью различать раздельно две близко расположенные точки. Предел разрешения — минимальное расстояние, на котором эти точки еще видны раздельно, — зависит от длины световой волны, освещающей объект, и числовой апертуры объектива. Числовая апертура, в свою очередь, зависит от угловой апертуры объектива и показателя преломления среды, находящейся между фронтальной линзой объектива и препаратом. Угловая апертура — это максимальный угол, под которым могут попадать в объектив лучи, прошедшие через объект. Чем больше угловая апертура и чем ближе показатель преломления среды, находящейся между объективом и препаратом, к показателю преломления стекла, тем выше разрешающая способность объектива.

Различают полезное и бесполезное увеличение. Полезное увеличение обычно равно числовой апертуре объектива, увеличенной в 500-1000 раз. Более высокое окулярное увеличение не выявляет новых деталей и является бесполезным. В зависимости от среды, которая находится между объективом и препаратом, различают «сухие» объективы малого и большего увеличения (от 2,5х до 100х) и иммерсионные (лат. imraersio — погружение) с максимальной апертурой и увеличением (90х-100х).

«Сухим» называется объектив, между фронтальной линзой которого и препаратом находится воздух; иммерсионным — когда в пространство между исследуемым предметом и фронтальной линзой объектива вносится прозрачная среда (иммерсионная жидкость) с показателем преломления таким же, как у стекла (или близким к нему). Это обеспечивает увеличение числовой апертуры и разрешающей способности объектива. В качестве иммерсионной жидкости для объективов водной иммерсии используют дистиллированную воду, а для объективов масляной иммерсии — кедровое масло или специальное синтетическое иммерсионное масло. Использование синтетического иммерсионного масла предпочтительнее, поскольку его параметры более точно нормируются, и оно, в отличие от кедрового, не засыхает на поверхности фронтальной линзы объектива. Для объективов, работающих в ультрафиолетовой области спектра, в качестве иммерсионной жидкости используют глицерин. Нельзя пользоваться суррогатами иммерсионною масла, в частности вазелиновым маслом.

Изображение, полученное при помощи линз, грешит различными недостатками: сферической и хроматической аберрациями, кривизной поля изображения и др. В объективах, состоящих из нескольких линз, эти недостатки исправляются. В зависимости от степени исправления недостатков различают объективы ахроматы и более сложные — апохроматы. Соответственно объективы, в которых исправлена кривизна поля изображения, называются планахроматами и планапохроматами. Использование таких объективов позволяет получить четкое изображение по всему полю, тогда как изображение, полученное при помощи обычных объективов, имеет различную резкость в центре и по краям поля зрения. Характеристики объектива обычно выгравированы на его оправе: собственное увеличение, апертура, тип объектива (АПО — апохромат и т.п.). Объективы водной иммерсии имеют обозначение ВИ и белое кольцо вокруг оправы в нижней ее части, объективы масляной иммерсии — обозначение МИ и черное кольцо. Объективы рассчитаны на работу со стандартным покровным стеклом толщиной 0,17 мм. Толщина покровного стекла особенно влияет на качество изображения при работе с сильными сухими системами (40х). При работе с иммерсионными объективами нельзя пользоваться покровными стеклами толще 0,17 мм, поскольку толщина покровного стекла может оказаться больше, чем рабочее расстояние объектива, и в этом случае при попытке сфокусировать объектив на препарат может повреждаться фронтальная линза объектива.

Принципиальная схема микроскопа и осветительной системы:
1 — источник света; 2 — коллектор; 3 — ирисовая полевая диафрагма; 4 — зеркало; 5 — ирисовая аппертурная диафрагма;
6 — конденсор; 7 — препарат; 7' — увеличенное действительное промежуточное изображение препарата, получаемое при помощи объектива; 7" — увеличенное мнимое окончательное изображение препарата, наблюдаемое через окуляр;
8 — объектив; 9 — выходной значок объектива; 10 — полевая диафрагма окуляра; 11 — окуляр; 12 — глаз

При работе с объективами, дающими большое увеличение, — с сильными сухими (40х) и иммерсионными (90х) системами, чтобы не повредить фронтальную линзу, при фокусировке пользуются следующим приемом. Наблюдая сбоку, опускают объектив макровинтом почти до соприкосновения с препаратом, затем, глядя в окуляр, макровинтом очень медленно поднимают объектив до появления изображения и при помощи микровинта осуществляют окончательную фокусировку микроскопа.

4. Окуляры (ocularis — глазной) — обращенная к глазу оптическая система, состоящая из двух линз (взятых в обойму) и предназначенная для построения микроскопического изображения на сетчатке глаза. Их вставляют в зрительную трубу микроскопа или его бинокулярной насадки с целью дополнительного устранения недостатков изображения. Окуляры бывают нескольких типов, каждый из которых применяется с определенным типом объектива. Тип окуляра и увеличение обозначены на его оправе. Для измерения размеров наблюдаемого объекта используются специальные окуляр-микрометры с вмонтированной в них масштабной сеткой с делениями.

5. Конденсор расположен под предметным столиком. Он предназначен для фокусирования на препарате света, направляемого зеркалом микроскопа, или от накладного либо встроенного осветителя. В конденсоре имеется апертурная диафрагма, необходимая для правильного освещения препарата. Конденсор светлого поля рассчитан на проходящее освещение препарата, а конденсор темного поля — на освещение препарата полым световым конусом.

6. Осветитель состоит из низковольтной лампы накаливания, трансформатора, коллекторной линзы и полевой диафрагмы, от раскрытия которой зависит диаметр освещенного поля на препарате. Зеркало направляет свет от осветителя в конденсор. Для того чтобы сохранить параллельность лучей, идущих от осветителя в конденсор, необходимо использовать только плоскую сторону зеркала.

Видео микроскопические методы исследования: световая, темнопольная, фазово-контрастная, люминесцентная и электронная микроскопии

- Читать далее "Настройка микроскопа: освещения по Келлеру и фокусировки микроскопа"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 9.05.2019