а) Выявление молочно-кислых микроорганизмов в пищевых продуктах (кроме кисло-молочных продуктов, заквасок и т. п.). Для определения присутствия молочно-кислых микроорганизмов или для их подсчета методом НВЧ производят высев по 1 см³ продукта и (или) его разведений в жидкую среду. Причем при определении НВЧ высевают три последовательные навески продукта и (или) его разведения, отличающиеся по количеству продукта в 10 раз.

Каждую навеску и (или) разведение по 1 см³ в трехкратной повторности высевают в пробирки с одной из жидких питательных сред. Для ограничения доступа кислорода воздуха в каждую пробирку вносят стерильный жидкий парафин (высота столбика парафина 2 см).

Для выявления присутствия или для подсчета количества молочно-кислых микроорганизмов можно также использовать плотные агаризованные среды. Для этого по 1 см³ продукта и (или) его разведений вносят в стерильные чашки Петри. Не позднее чем через 15 мин посевы заливают 15-20 см³ расплавленной и охлажденной до 45(±1)°С агаризованной среды. Содержимое чашек немедленно осторожно перемешивают круговыми движениями и оставляют до застывания среды.

Для ограничения доступа кислорода воздуха можно после застывания среды влить второй слой среды (5 см³) или воспользоваться одним из способов культивирования посевов в анаэробных условиях. Засеянные чашки с застывшей средой переворачивают.

При необходимости выявления и учета бактерий рода Leuconostoc используют поверхностный метод посева на агаризованную среду (объем посевного материала 0,1-0,2 см³) или метод мембранной фильтрации. Инокулят тщательно равномерно распределяют по всей поверхности подсушенной среды в чашке Петри стерильным стеклянным шпателем. Мембранные фильтры с осевшими на них бактериями помещают на поверхность среды, не переворачивая. Чашки с посевами бактерий рода Leuconostoc инкубируют дном вниз.

Посевы инкубируют в условиях, соответствующих выявляемым микроорганизмам. При ежедневном просмотре посевов в жидкие среды отбирают пробирки с признаками роста микроорганизмов и производят пересев выделенных культур методом истощающего штриха на поверхность соответствующих агаризованных сред. При определении численности микроорганизмов методом посева на плотные среды отбирают для подсчета те чашки Петри, на которых выросло от 15 до 150 характерных колоний (при анализе методом мембранных фильтров можно производить подсчет, даже если на фильтре выросло менее 15 колоний).

Для подтверждения принадлежности выделенных характерных колоний к интересующим микроорганизмам отбирают не менее пяти таких колоний. Из материала каждой выбранной колонии готовят мазки и окрашивают их по Граму. Подвижность бактерий выявляют путем микроскопии препаратов, приготовленных методом раздавленной или висячей капли. Если необходимо выявить капсулы (при определении бактерий рода Leuconostoc), готовят препараты и окрашивают их по Бури.

Каталазу определяют методом, описанным в отдельной статье на сайте. При этом следует помнить, что бактерии рода Pediococcus могут разлагать перекись водорода за счет наличия псевдокаталазы. Поэтому при определении молочно-кислых микроорганизмов или бактерий рода Pediococcus в случае выделения грамположительных неподвижных бактерий, дающих положительную каталазную реакцию, обязательно проводят бензидиновый тест (для контроля отсутствия цитохромов). Для этого колонии микроорганизмов (24-48-часовые культуры), заливают раствором бензидина. После того как раствор пропитает колонии, вносят в чашку приблизительно такой же объем 5 % перекиси водорода.

Если бактерии содержат цитохромы, то колонии приобретают голубовато-зеленый или ярко-голубой цвет. Молочно-кислые микроорганизмы (в том числе бактерии рода Pediococcus) цитохромов не содержат.

Для выявления способности роста на МПБ с pH 9,6 и на МПБ с 6,5% NaCl при подтверждении стрептококков группы N рода Streptococcus или Streptococcus thermophilus культуры высевают на указанные среды и инкубируют трое суток соответственно при 30(±1)°С и при 45(±1)°С.

Суммируют полученные результаты и оценивают их используя сведения, приведенные в таблице 5.22. Если при подтверждении характерных колоний не менее четырех из выбранных пяти (т. е. не менее 80%) можно отнести к интересующим молочнокислым бактериям, то все характерные колонии на чашке Петри принадлежат к этим бактериям. В остальных случаях количество интересующих молочнокислых бактерий определяют исходя из процентного отношения подтвержденных колоний к общему количеству характерных колоний, взятых для подтверждения.

НВЧ молочно-кислых микроорганизмов в 1 г (1 см³) продукта рассчитывают по количеству пробирок с положительными результатами посева пользуясь таблицей ниже.

Пересчет количества молочно-кислых бактерий на 1 г (см³) продукта при учете на плотных средах осуществляют по формуле:

M = NC/m,

где М—количество микроорганизмов в 1 г (см³) продукта;

N — степень разведения навески;

n — количество инокулята, внесенное для посева в чашку Петри;

С — округленное среднеарифметическое значение числа колоний.

Конечный результат вычисления выражают числом от 1,0 до 9,9x10ⁿ.

б) Исследование кисло-молочных продуктов, заквасок, бактериальных препаратов и т. п. Для приготовления разведений в асептических условиях отбирают 1 г исследуемого материала в стерильную или профламбированную ступку, прикрытую крышкой от чашки Петри или стерильной бумагой. Навеску тщательно растирают, добавляя немного изотонического раствора NaCl или фосфатного буфера из колбы, содержащей 99 см³ раствора (буфера). Затем полученную суспензию переносят в колбу с оставшимся раствором (буфером). Таким образом получают разведение 10^-2 (1:100), которое является базовым для приготовления последующих десятикратных разведений.

Для определения количества молочно-кислых стрептококков по 1 см³ из соответствующих разведений продукта засевают в чашки Петри с агаром с гидролизованным молоком или в пробирки со стерильным обезжиренным молоком (делают по два параллельных посева на каждое разведение).

При подсчете количества молочно-кислых палочек по 1 см³ из каждого разведения вносят в две параллельные пробирки со стерильным обезжиренным молоком.

Для подсчета мезофильных молочно-кислых бактерий посевы культивируют 72 ч при температуре 30(±1)°С, термофильных молочно-кислых бактерий — при 40(±1)°С, а для совместного подсчета мезофильных и термофильных молочнокислых бактерий — при 32(±1)°С.

Расчет количества молочно-кислых микроорганизмов в 1 г (1 см³) исследуемого продукта при учете на плотной среде осуществляют как описано в отдельной статье.

О развитии молочно-кислых микроорганизмов свидетельствует свертывание молока. Для подсчета общего количества молочно-кислых бактерий (стрептококков и палочек) отмечают три последних разведения, в которых молоко свернулось. Составляют числовую характеристику, состоящую из трех цифр: первая цифра— разведение, при посеве которого свернулось молоко в обеих пробирках, вторая и третья цифры — число пробирок со свернувшимся молоком в двух последующих разведениях. Пользуясь таблицей ниже, находят НВЧ молочно-кислых микроорганизмов.

Для того чтобы найти количество молочно-кислых бактерий в 1 г (1 см³) исследуемого продукта необходимо полученное значение НВЧ умножить на то разведение, с которого начинается первая цифра числовой характеристики.

Если необходимо отдельно подсчитать количество кокков и палочек, то из пробирок со свернувшимся молоком готовят препараты, микроскопируют их и отмечают посевы, в которых обнаруживаются искомые микроорганизмы. В дальнейшем при подсчете поступают, как указано выше.

в) Выявление молочно-кислых микроорганизмов при определении промышленной стерильности консервов. Для выявления молочно-кислых микроорганизмов по 1 г (1 см³) консервированного продукта вносят параллельно в двк чашки Петри и заливают расплавленной и остуженной до 45(±1)°С средой (среда Бликфельдта, или капустный агар, или среда Рогоза, или среда МРС). Содержимое чашек аккуратно перемешивают круговыми движениями. После застывания среды чашки переворачивают. Для посева можно также использовать жидкую среду (Бликфельдта, Рогоза, МРС), разлитую в пробирки.

Если после внесения продукта в жидкую среду Бликфельдта среда изменила цвет, то в нее добавляют несколько капель стерильного раствора 50 г/дм³ NaOH (или КОН) до восстановления первоначальной окраски.

Посевы термостатируют при 30(±1)°С не более 5 сут. или при 37(±1)°С не более 3 сут. Принадлежность к молочно-кислым бактериям устанавливают по культуральным признакам, морфологии клеток, окраске по Граму, отсутствию каталазы. Микроорганизмы, выделенные в посевах, классифицируют, особо выделяют молочно-кислые бациллы (типовой вид Sporolactobacillus inulinus) — мезофильные спорообразующие грамположительные палочки, микроаэрофилы, каталазоотрицательные, которые обладают бродильным типом метаболизма и образуют только молочную кислоту.

- Читать далее "Выявление Listeria monocytogenes в пищевых продуктах"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 14.10.2019