Методы исследования мозга в поведенческой нейронауке

а) Исследование 1. Настройка на речь. Движущей силой изучения организации и функционирования человеческого мозга преимущественно являются новые технологии. В последние десятилетия были разработаны принципиально новые неинвазивные методы визуализации активности мозга человека в состоянии бодрствования.

Один из таких методов, функциональное исследование мозга с использованием ближней инфракрасной спектроскопии (БИС), предполагает визуализацию степени оксигенации мозга путем анализа света, пропускаемого тканями коры больших полушарий. Описание БИС, одной из разновидностей оптической томографии, приведено в разд. 7-4.

Функциональное исследование мозга с использованием БИС позволяет ученым использовать оксигенацию в качестве показателя нейронной активности в отдельных областях коры, в том числе у новорожденных. В рамках одного из исследований (May et al., 2011) новорожденным (возраст 0-3 дня), когда они слушали речь на знакомом языке и на незнакомых языках, надевали сетчатую шапочку, содержащую оптоволоконную БИС-систему.

Когда новорожденные слышали знакомый язык, в их мозге наблюдалось увеличение концентрации оксигемоглобина. Когда они слышали незнакомый язык, общая концентрация оксигемоглобина падала. Однако когда новорожденные слушали те же предложения, воспроизведенные в режиме «реверс», различия в ответах мозга на разные языки отсутствовали.

Различия в ответах на знакомый язык и другие незнакомые языки говорят о том, что ответ мозга новорожденного обусловлен пренатальным опытом. Это открытие вызывает множество вопросов. Например: как знакомство с языком в пренатальном периоде влияет на последующее изучение языка? Правда ли, что дети, познакомившиеся до рождения с несколькими языками, овладевают речью быстрее, чем дети, познакомившиеся до рождения только с одним языком?

На каком этапе внутриутробного развития должно произойти знакомство с языком и в каком объеме? Одинаковые ли результаты показывают недоношенные и доношенные дети?

Какими бы ни были ответы, это исследование показывает, что в процессе внутриутробного развития происходит настройка мозга на ту языковую среду, в которой ребенку предстоит существовать после рождения.

Новорожденный с датчиками на голове Расположение датчиков на схематическом изображении левого и правого полушарий мозга новорожденного. Красными точками обозначены испускающие свет волокна; синими точками обозначены детекторы. Детекторы, в обоих полушариях находящиеся во внешнем ряду, располагаются над зонами, отвечающими за речь у взрослых

Простота и неинвазивный характер функциональных исследований мозга с использованием БИС, описанных выше, возможно, позволят применить указанный метод не только для изучения развивающегося мозга, но и для исследования мозговой деятельности взрослых. В грядущие десятилетия основной движущей силой исследований связи между мозговой деятельностью и поведением станут как новые технологии, так и разумное применение уже существующих технологий.

Если бы мы жили раньше XX в. и были заинтересованы в изучении работы мозга, в нашем распоряжении было бы всего два метода исследования. Мы могли бы начать с изучения поведения людей с повреждениями мозга и неврологическими нарушениями, а затем после их смерти исследовать их мозг, чтобы определить, какие именно отделы мозга связаны с той или иной недостаточностью. Кроме того, мы могли бы намеренно повредить мозг животного, чтобы посмотреть, как изменится его поведение. Именно эти способы применяли для изучения связи между мозговой деятельностью и поведением еще в XX в.

Несмотря на то что применяемые в наше время нейробиологами методы по сложности намного превосходят более ранние методы, современные и традиционные методы имеют много общих черт. Мы по-прежнему изучаем поведение и на отдельные аспекты мозговой деятельности на людях с неврологическими нарушениями и на модельных животных. Мы также можем воздействовать на функцию мозга путем специфически контролируемого увеличения или уменьшения активности, а также определения влияния изменений активности на поведение.

Основное отличие современных методов от традиционных состоит в том, что сейчас мы имеем возможность применять для измерения мозговой активности и воздействия на мозг большее число инструментов, при этом многие из них являются неинвазивными и позволяют воздействовать на мозг на молекулярном уровне.

Достижения в области молекулярной генетики и анализа поведения начала 1950-х гг. подготовили почву для настоящего прорыва в нейронауке. Ученые признают, что новые технологии позволяют делать новые открытия, ставят перед исследователями новые вопросы и переводят исследования на принципиально новый уровень. Многие ученые были удостоены различных наград, в том числе Нобелевской премии, за разработку и внедрение новых методов.

В наше время в исследованиях связи между мозговой деятельностью и поведением задействованы анатомы и генетики, психологи и физиологи, химики и физики, эндокринологи и неврологи, фармакологи и психиатры, программисты, инженеры и биологи. Выбор доступных исследователям методов в XXI в. поражает.

В начале мы расскажем о том, как ученые исследуют поведение человека и других животных, а также о том, как нейробиологи управляют поведением, воздействуя на мозг. Затем мы рассмотрим электрические методы регистрации мозговой активности, в том числе ЭЭГ, неинвазивные методы нейровизуализации, такие как функциональное исследование мозга с использованием БИС, а также химические и генетические методы исследования и воздействия на мозг и поведение. Сравнив эти методы в отдельной статье на сайте, мы обсудим проблемы, связанные с использованием животных для исследований.

б) Исследования и воздействие на мозг и поведение. На лекции, которая состоялась в 1861 г. в рамках встречи Парижского антропологического общества, врач Эрнест Обюртен (Ernest Auburtin) утверждал, что за речевые функции отвечают лобные доли мозга. Пятью днями позже его коллега, врач Поль Брока (Paul Broca), наблюдал пациента с повреждениями мозга, который утратил речь и был в состоянии произнести лишь слово «тан». Пациент вскоре умер. Брока и Обюртен исследовали мозг мужчины и обнаружили поражение левой лобной доли.

К 1863 г. Брока пронаблюдал восемь похожих случаев и пришел к выводу, что за производство речи отвечает третья лобная извилина — эту область сейчас называют зоной Брока. Открытия Брока вдохновили других ученых на исследование связи между мозговой деятельностью и поведением на пациентах. Так возникла наука, которую в наше время называют нейропсихологией, — она изучает связь между функциями мозга и поведением человека. В наше время для изучения мозга и поведения применяют неинвазивные методы нейровизуализации, комплексные анатомические исследования и сложный поведенческий анализ.

в) У истоков поведенческой нейронауки. В начале XX в. основным инструментом изучения нейроанатомии были гистологические исследования — при посмертном исследовании срезы тканей (от греч. histos — ткань) мозга окрашивали различными красителями. Как показано на рис. 7.1, прогресс в микроскопии связан с увеличением разрешающей способности и специфичности метода, а также с переходом от исследования мертвых тканей к визуализации тканей живых. Ученые имеют уникальную возможность окрашивать тела нейронов для последующего изучения под световым микроскопом (рис. 1, А) или применять селективное окрашивание отдельных нейронов для последующего изучения их структуры (рис. 1, Б). Электронный микроскоп (рис. 1, В) позволяет рассмотреть структуру синапсов, а мультифотонная микроскопия (рис. 1, Г) позволяет получить трехмерное изображение живой ткани.

К началу XX в. применение световой микроскопии позволило исследователям, в том числе Корбиниану Бродману (Korbinian Brodmann), поделить кору больших полушарий на отдельные зоны в соответствии с особенностями образующих эти зоны нейронов. Ученые предположили, что такие зоны коры могут выполнять специфические функции. В начале XXI в. были разработаны десятки методов для мечения нейронов и связей между ними, а также для мечения глиальных клеток, В наши дни микроскопию сверхвысокого разрешения также применяют для идентификации местоположения различных рецепторов на клеточных мембранах.

Рисунок 1. Окрашивание нейронов головного мозга. А. При исследовании окрашенного по методу Ниссля среза теменной коры можно увидеть тела нейронов, но не их отростки (аксоны и дендриты). Б. При более высоком разрешении видны отдельные окрашенные по методу Гольджи пирамидные нейроны теменной коры. Тело нейрона (темный треугольник в центре) и ветвящиеся дендриты (А и В) можно рассмотреть во всех подробностях. В. Электронный микроскоп позволяет рассмотреть строение синапсов. Г. Большое число изображений, полученных с помощью мультифотонного микроскопа, объединяют, чтобы создать трехмерное изображение живой ткани

Современные методы позволяют ученым идентифицировать молекулярные, биохимические и морфологические (структурные) различия между нейронами разных типов, чтобы в конечном итоге связать эти особенности с поведением. Существуют даже миниатюрные микроскопы, которые можно установить на черепе мыши. Такие минископы позволяют одновременно наблюдать за десятками и сотнями нейронов в мозге свободно двигающейся мыши посредством визуализации флуоресцентного сигнала, изменяющегося в зависимости от уровня кальция, который является показателем возбуждения нейронов (Ghosh et al., 2011).

Такие методы визуализации нейронов играют ключевую роль в исследованиях связи между анатомическими особенностями и поведением — об этом свидетельствуют многочисленные эксперименты на животных, в рамках которых животные выполняют различные тесты на обучаемость, в том числе на пространственное ориентирование в лабиринте. Обучаемость может коррелировать с разнообразными нейроанатомическими изменениями, в том числе с изменениями синапсов в специфических областях коры больших полушарий (например, зрительной коры у животных, ориентирующихся в лабиринте с помощью зрения) или изменением числа вновь образовавшихся клеток, сохранившихся в зубчатой извилине, — отдельной области гиппокампа. У млекопитающих эта структура отвечает за запоминание контекста полученной информации.

Результаты экспериментов показали, что подавление роста новых нейронов зубчатой извилины приводит к определенным расстройствам памяти. Чтобы проверить, действительно ли нейроны зубчатой извилины отвечают за эпизодическую память (сохранение контекстной информации об объекте), ученые исследовали здоровых и адреналэктомированных крыс — животных с удаленными надпочечниками, у которых не вырабатывается гормон кортикостерон. В отсутствие кортикостерона нейроны зубчатой извилины погибают.

P.S. Кортикостерон — секретируемый при стрессе стероидный гормон, участвует в белковом и углеводном обмене.

Раздел «Эксперимент 1», п. «Процедура 1» демонстрирует изображения зубчатой извилины здоровой крысы (слева) и дегенерации нейронов у адреналэктомированной крысы после операции (справа). Поведение здоровых и адреналэктомированных крыс во время теста на способность переключаться между объектами и ситуациями представлено на рисунке в п. «Процедура 2». На этапе дрессировки крыс помещали в разные установки (А и Б) на 10 мин в день в течение двух дней. Каждая из установок содержала определенные объекты.

В день тестирования крыс помещали в установку А или Б, содержащую два разных объекта. Один из объектов ранее находился в этой же установке, а второй был перемещен из другой установки.

Как показано в п. «Результаты», когда здоровые крысы сталкиваются с объектами в знакомой обстановке, им требуется немного времени, чтобы исследовать объект. Если же крысы встречаются с объектами в незнакомой обстановке, они проявляют большую любознательность и тратят примерно три четверти своего времени на исследование объекта, по-видимому, расценивая объект как новый. Однако адреналэктомированные крысы с меньшим числом нейронов в зубчатой извилине реагируют на объекты в знакомой и незнакомой установке почти одинаково — они тратят примерно половину времени на исследование каждого объекта.

Другой группе адреналэктомированных крыс создали условия, способствующие образованию новых нейронов в зубчатой извилине — им давали обогащенные корма и заставляли бегать в колесе. Поведение таких крыс во время теста не отличалось от поведения здоровых крыс. Раздел «Эксперимент 1» показывает, что изменения зубчатой извилины на клеточном уровне и поведенческие изменения тесно связаны между собой — нейроны зубчатой извилины необходимы для запоминания контекстной информации.

г) Исследование 2. Брэйнбоу — радужные нейроны. Если бы не создание красителей, позволяющих окрашивать отдельные компоненты клеток мозга, мы не смогли бы оценить сложность структуры этих клеток и их связей. Жан Ливет (Jean Livet, 2007) и его коллеги из Гарвардского университета разработали трансгенную технологию, которая предполагает мечение различных нейронов путем окрашивания их в разные цвета — такой метод получил название Брэйнбоу (от англ, rainbow — радуга).

Взяв за основу то, как жидкокристаллический или светодиодный экран отображает весь распознаваемый человеческим глазом диапазон цветов, используя только красный, зеленый и синий цвета, создатели метода Брэйнбоу внедрили в мышиные клетки гены, отвечающие за выработку синего, зеленого и красного флуоресцентных белков. Ген красного белка получен из коралла, а гены зеленого белка получены из медуз. (В 2008 г. за открытие и разработку методов применения флуоресцентных белков кораллов и медуз Нобелевскую премию по химии получили Роджер Цянь, Осаму Симомура и Мартин Чалфи.)

В мышиный геном также внедрили бактериальный ген Сге, обеспечивающий активацию описанных выше генов в каждой клетке. Однако из-за случайных факторов уровень активности отдельных генов варьирует. Изменяющаяся в процессе развития мыши экспрессия генов, кодирующих флуоресцентные белки, позволяет получить клетки не менее чем 100 оттенков. При исследовании с помощью флуоресцентного микроскопа, чувствительного к соответствующим значениям длины волны, можно визуализировать отдельные клетки мозга и их связи, так как их оттенки различаются (см. микрофотографии).

Обеспечивающий возможность визуализации отдельных клеток метод Брэйнбоу позволяет описать процессы передачи информации нейроном и связи между нейронами. Вы, безусловно, видели электрические кабели, внутри которых находятся разноцветные провода (черные, белые, красные). Цвет проводов показывает, для чего они предназначены и как их следует соединять. Позволяющий визуализировать живую ткань мозга в чашке Петри метод Брэйнбоу дает возможность проследить за изменениями нейронных цепей с течением времени.

В будущем метод Брэйнбоу может оказаться полезным для изучения популяций клеток и их соединений, в том числе клеток, связанных с определенными заболеваниями мозга. Гены Брэйнбоу могут включаться в определенные периоды, например с возрастом или во время решения задач (Rojczyk-Goiebiewska et al., 2015). Несмотря на то что метод Брэйнбоу является многообещающим, его применение связано с определенными сложностями. Даже очень примитивный мозг содержит бесчисленное множество нейронов и волокон. Для исследования соединений между клетками необходимы модификации метода Брэйнбоу, предназначенные для визуализации лишь нескольких клеток и волокон.

д) Методы исследования, применяемые в поведенческой нейронауке. Поведенческая нейронаука изучает биологические основы поведения. Это наука о связи между мозговой деятельностью и поведением у человека и других животных. Тест на эпизодическую память, описанный в разд. «Эксперимент 1», — это один из сотен применяемых нейробиологами поведенческих тестов. В этом разделе мы расскажем о нескольких способах нейропсихологического тестирования человека, а также о нескольких тестах на пространственную ориентацию и выполнение сложных движений, в том числе об одном тесте для грызунов, предполагающем применение устройства с сенсорным экраном.

Основная задача изучающих поведение нейробиологов состоит в разработке методов изучения типичного и нетипичного поведения. Способы, применяемые для исследования поведения человека и лабораторных животных, принципиально различаются ввиду способности человека к речи. Ученые могут расспросить испытуемого о его симптомах, дать ему бумагу и карандаш или предложить пройти компьютеризированный тест, чтобы выявить специфические симптомы.

Изучать поведение лабораторных животных сложнее. Исследователям приходится говорить на крысином языке, работая с крысами, и на обезьяньем языке, работая с обезьянами. Это значит, что ученым необходимы методы, позволяющие выявлять симптомы у животных. Развитие таких направлений, как изучение обучаемости животных и этология (наука о генетически обусловленном поведении животных, прежде всего в естественной среде их обитания), составляет основу современной поведенческой нейробиологии (см. Whishaw & Kolb, 2005).

Эксперимент 1. Участвуют ли нейроны гиппокампа в запоминании?

Процедура 1. Гиппокамп крысы до (слева) и после (справа) хирургического удаления надпочечников. Обратите внимание на уменьшение числа нейронов вследствие отсутствия кортикостерона.

Процедура 2. Поведение здоровых крыс, не получавших специального ухода адреналэктомированных крыс и адреналэктомированных крыс, получавших уход, способствующий образованию новых нейронов в зубчатой извилине (обогащенные корма и бег в колесе), во время теста на контекстную память об объекте с использованием двух установок, содержащих объекты различных типов.

Результаты. Здоровые крысы исследуют перемещенный из другой установки объект дольше, чем объект, ранее находившийся в этой установке. Не получавшие специального ухода адреналэктомированные крысы показывают случайные результаты. А у адреналэктомированных крыс, которые получали обогащенные корма и бегали в колесе, образуются новые нейроны зубчатой извилины, и их поведение в результате не отличается от поведения здоровых крыс.

На фото ниже изображен гиппокамп крысы. Для идентификации новых нейронов зубчатой извилины использован специальный метод окрашивания — новые нейроны окрашены в желтый цвет.

Вывод. Нейроны зубчатой извилины необходимы для запоминания контекстной информации.

Нейропсихологические тесты на три различные формы памяти представлены на рис. 2. В рамках зрительно-пространственного теста Кореи, представленного на рис. 2, А, испытуемому предлагают посмотреть на созданную психологом последовательность кубиков — например, последовательность из кубиков 4, 6, 1, 8, 3. Задача состоит в том, чтобы правильно воспроизвести последовательность кубиков. Испытуемый не видит номера на кубиках — ему необходимо запомнить расположение кубиков.

Рисунок 2. Нейропсихологические тесты для оценки памяти

1. Нейропсихологическое тестирование человека. Мозг регулирует невероятное количество функций — от контроля движений и сенсорного восприятия до памяти, эмоций и речи. Следовательно, любой анализ поведения должен быть адаптирован к определенной функции. Давайте рассмотрим анализ памяти.

Люди с повреждениями височных долей часто жалуются на проблемы с памятью. Однако память — это не одна выполняемая функция. Существует целый ряд отвечающих за память независимых систем. Помимо всего прочего, мы запоминаем события, цвета, имена, места и двигательные навыки — каждую из указанных форм памяти следует рассматривать и исследовать отдельно. Одновременное нарушение всех форм памяти встречается крайне редко.

P.S. В статьях на сайте мы называем принимающих участие в исследованиях здоровых добровольцев испытуемыми, а людей с нарушениями мозговых функций и поведенческими расстройствами — пациентами.

Тест Кореи позволяет оценить объем кратковременной памяти и ее зрительно-пространственный компонент. Тест можно усложнить, определив, какое максимальное число объектов испытуемый способен запомнить за раз (например, 6 кубиков), а затем добавив один объект (максимальное число объектов, которое испытуемый способен запомнить за раз, + еще 1 объект). Очевидно, что первая попытка окажется неудачной, однако при многократном предъявлении максимального числа объектов, которое испытуемый способен запомнить за раз, + еще 1 объект, испытуемый в конце концов научится воспроизводить последовательность без ошибок.

Переход к максимальному числу объектов, которое испытуемый способен запомнить за раз, + еще 1 объект задействует другую форму памяти. Различные типы неврологической дисфункции по-разному влияют на выполнение задач, на первый взгляд кажущихся очень похожими. Максимальное число объектов, которое испытуемый способен запомнить за раз, используется для оценки кратковременной памяти, в то время как максимальное число объектов, которое испытуемый способен запомнить за раз, + еще 1 объект позволяет оценить обучаемость и долговременную память.

В рамках теста с отраженным в зеркале объектом (рис. 2, Б) испытуемому предлагают воспроизвести контур (например, звезды), глядя в зеркало. Этот двигательный тест поначалу кажется сложным, поскольку отражение руки в зеркале двигается в обратном направлении. Со временем испытуемые научаются правильно выполнять задание, а повторное тестирование через несколько дней показывает, что полученный навык в значительной степени сохраняется. Интересно, что пациенты с определенными расстройствами памяти не помнят, что уже выполняли такое задание, но, несмотря на это, выполняют его безупречно.

В тесте на недавнюю память (рис. 2, В) испытуемым демонстрируют множество карточек, на каждой из которых нарисованы два стимула -слова или изображения. На некоторых карточках между объектами стоит вопросительный знак. Испытуемым предлагают ответить, видели ли они определенные объекты раньше и какие объекты они видели последними. Испытуемые в состоянии вспомнить, видели ли они объекты раньше, однако они могут быть не в состоянии вспомнить, какой объект они видели последним. Возможна и обратная ситуация — испытуемые могут быть не в состоянии идентифицировать объекты, но при этом они правильно выбирают последний из увиденных объектов.

Парадоксальный характер последнего наблюдения говорит о необходимости разработки исследователями поведения оригинальных методов оценки памяти. Недостаточно просто попросить испытуемого вспомнить что-либо и выразить это в вербальной форме, хотя это тоже можно применять для исследования некоторых форм памяти.

2. Анализ поведения грызунов. За последнее столетие ученые, заинтересованные в изучении лежащих в основе ощущений, познания, памяти, эмоций и движения нейронных механизмов, разработали огромное количество лабиринтов и других тестов и заданий для исследования нейронных механизмов, обуславливающих специфические формы поведения лабораторных животных. У крыс очень большой поведенческий репертуар — это значит, что они обладают множеством способностей, часть из которых перечислена в табл. 1. Их способности можно исследовать по отдельности, чтобы понять функциональную подоплеку различных форм поведения.

На рисунке 3 представлены три теста, разработанные на основе предложенного Ричардом Моррисом (Richard Morris, 1981) теста «Водный лабиринт Морриса». Крыс помещают в большой бассейн с высокими скользкими бортиками, не позволяющими крысам вылезти из бассейна. Платформа (остров) скрыта под водой. Крысы потрясающие пловцы, они быстро перемещаются по бассейну и в конце концов наталкиваются на платформу. Когда они вылезают на платформу, их вынимают из бассейна и возвращают в клетку — более комфортное для них место.

Рисунок 3. Плавательные тесты. Общий вид бассейна, используемого в трех вариантах теста «Водный лабиринт», предназначенного для оценки визуально-пространственной памяти крыс. На рисунках А, Б и В красными линиями обозначена траектория движения крысы в каждом из экспериментов (Т).

В одном из вариантов теста крыса должна научиться находить платформу, перемещаясь к ней от разных точек выпуска (рис. 3, А). Все возможные ориентиры располагаются за пределами бассейна, то есть крысе необходимо научиться ориентироваться по расположению объектов в помещении относительно платформы.

Другой вариант теста предполагает, что крыса уже знает о существовании платформы, однако каждый день ее выпускают в бассейн в новой точке. Выпущенная в воду крыса ищет платформу (рис. 3, Б). Когда крыса находит платформу, ее вынимают из бассейна, а затем, после короткого перерыва (например, перерыва продолжительностью 10 с), снова выпускают в воду. Задача крысы — проплыть прямо к платформе. Смысл теста на пространственную память состоит в том, что крысе приходится выбирать стратегию последовательного поиска платформы — в течение одного дня платформа остается на одном месте, однако на следующий день ее перемещают.

Наиболее популярный вариант теста предполагает определение местонахождения платформы по ориентирам на бортиках бассейна (рис. 3, В). В каждом новом эксперименте платформу перемещают на новое место, однако ее положение относительно ориентира не меняется. В этом случае мозг узнает о том, что внешние ориентиры, находящиеся за пределами бассейна, не имеют значения — ориентироваться следует только по знакам внутри бассейна. Крысы с различными неврологическими нарушениями демонстрируют разные результаты при выполнении трех вариантов теста «Водный лабиринт».

Другой вид поведенческого анализа предполагает оценку двигательной активности крыс. Основной проблемой, с которой сталкиваются пациенты с инсультом, является невозможность контролировать движения верхних и нижних конечностей. Интерес к созданию методов анализа двигательной функции с целью разработки новых способов лечения и реабилитации обусловлен распространенностью инсульта. В одном из тестов крыс учат доставать сладкие съедобные шарики через щель.

Движения крысы, очень похожие на аналогичные движения человека, можно разделить на отдельные двигательные сегменты. Исследователи имеют возможность оценивать такие сегменты по отдельности, поскольку на них по-разному влияют различные типы неврологических нарушений.

Серия фотографий на рис. 4 показывает, как крыса усаживается напротив щели (А), просовывает переднюю лапу в щель (Б), разворачивает лапу горизонтально, чтобы схватить пищу (В), а затем разворачивает лапу вертикально и вытаскивает ее, чтобы забрать пищу (Г). Приматы — не единственные животные, способные совершать точные движения пальцами, однако из-за того, что передние лапы крыс маленькие и двигаются очень быстро, ловкость их пальцев заметна только при замедленном воспроизведении видео.

Рисунок 4. Сложные движения крыс. На фотографиях представлены крысы, обученные доставать съедобные шарики, просовывая лапы через узкую вертикальную щель. А. Крыса нацеливает лапу. Б. Тянется к пище. В. Хватает пищу. Г. Вытаскивает пищу и подносит ее ко рту

Тим Буссей (Tim Bussey), Лайза Саскида (Lisa Saksida) и их коллеги разработали устройство с сенсорным экраном для исследования когнитивных способностей и мотивации грызунов (рис. 5). Это изобретение позволяет свести на нет вариабельность поведения и стресс, связанные с присутствием человека во время проведения тестов. Кроме того, устройство можно запрограммировать таким образом, чтобы воспроизвести задания, применяемые для оценки когнитивных способностей человека (Oomen et al., 2013 Phillips et al., 2018).

Рисунок 5. Устройство с сенсорным экраном для исследования поведения грызунов. Мышей или крыс помещают в устройство и поощряют их, давая клубничный молочный коктейль в случае правильного выбора изображения прикосновением к экрану

е) Воздействие на мозг и поведение. Основная стратегия, применяемая при исследовании связи между мозговой деятельностью и поведением, предполагает воздействие на отдельную функцию мозга и наблюдение за изменениями поведения. Ученые применяют такую стратегию, чтобы создать гипотезу о влиянии мозговой деятельности на поведение, а затем проверить эту гипотезу.

Вторая стратегия предполагает создание моделей неврологических и психических заболеваний на животных. Применяемая в неврологии и психиатрии презумпция предполагает возможность хотя бы частичного восстановления нормальной функции благодаря медикаментозной, поведенческой и иной терапии. Основным препятствием в разработке таких методов лечения, как и большинства других видов терапии, является необходимость их предварительного тестирования на животных.

Существуют различные способы воздействия на мозг, выбор которых зависит от цели исследования. Ученые имеют возможность воздействовать на весь организм животного, используя различные корма, социальные взаимодействия, физические упражнения, сенсорную стимуляцию и многое другое. Основные методы воздействия на мозг предполагают инактивацию мозга путем повреждения или с помощью препаратов либо активацию мозга с помощью электростимуляции, препаратов или света.

Специалисты в области поведенческой нейронауки воздействуют на мозг, а затем оценивают мозговую деятельность или поведенческий ответ. Существование множества различных методов воздействия и оценки ответа позволяет ученым комбинировать методы.

1. Повреждения мозга. Первый (и самый простой) метод воздействия на мозг предполагает удаление или разрушение тканей. Еще в 1920-х гг. этот метод впервые применил Карл Лешли (Karl Lashley), пионер в области исследований мозга. В течение следующих 30 лет он пытался обнаружить в головном мозге зону, отвечающую за память. Он дрессировал обезьян и крыс, используя разнообразные лабиринты и моторные задачи, а затем удалял участки коры больших полушарий, пытаясь вызвать исчезновение определенных воспоминаний.

К его огорчению, Лешли не удалось обнаружить отвечающую за память зону. Однако он заметил, что потеря памяти связана с объемом удаленной ткани. Вывод, к которому пришел Лешли, состоит в том, что память распределена в коре головного мозга, а не локализована в каком-либо из его отделов. Последующие исследования позволили получить убедительные доказательства того, что определенные функции мозга и связанные с ними воспоминания действительно локализованы в определенных областях мозга. По иронии судьбы, когда Лешли выходил на пенсию, Уильям Сковилл и Бренда Милнер (William Scoville, Brenda Milner, 1957) представили описание случая пациента, которого Сковилл прооперировал по поводу эпилепсии, удалив гиппокамп.

Операция привела к потере памяти. В своих экспериментах Лешли никогда не удалял гиппокамп, так как не подозревал о связи этой структуры с памятью. Поскольку гиппокамп не относится к поверхностным структурам мозга, требовалась разработка методов, позволяющих воздействовать на подкорковые структуры.

Решением проблемы доступа к подкорковым структурам стало применение стереотаксиса устройства, позволяющего исследователю или нейрохирургу воздействовать на целевую точку мозга хирургическим способом (рис. 6). Аппарат обеспечивает фиксацию головы. Постоянство расположения мозговых структур относительно стыков костей черепа позволяет визуализировать трехмерную карту мозга.

Рисунок 6. Стереотаксис. Такой аппарат позволяет точно определить координаты любого отдела мозга на основании его расположения относительно других отделов мозга и костей черепа

Рострально-каудальная (передне-задняя) ось соответствует оси у на рис. 6. Дорсо-вентральная ось (г) идет вдоль поверхности мозга. Медиально-латеральная ось (х) идет вдоль срединного шва. В результате посмертных исследований мозга человека и лабораторных животных были созданы анатомические атласы, позволяющие рассчитать координаты любой мозговой структуры.

Давайте рассмотрим сопровождающий болезнь Паркинсона тремор, из-за которого руки трясутся так сильно, что пациент не может удержать стакан с водой. Наиболее широко применяемый метод хирургического лечения предполагает сверление отверстия в черепе и применение полученных для конкретного пациента с помощью МРТ стереотаксических координат для хирургического воздействия на бледный шар. Внутрь бледного шара вводят электрод, на который подают ток, чтобы разрушить внутренний сегмент бледного шара и избавить пациента от тремора. Следует отметить, что такого же результата позволяет добиться новый неинвазивный метод, называемый фокусированным ультразвуком высокой интенсивности (IIIFU) (Quadri et al., 2018).

Указанный метод предполагает применение сфокусированных ультразвуковых пучков, направленных на одну и ту же точку в головном мозге. Отдельные ультразвуковые пучки не оказывают сколько-нибудь заметного влияния; энергия, создаваемая в точке пересечения пучков, обеспечивает нагрев тканей. Слабый нагрев приводит к временному нарушению функции отдельной области мозга, являющемуся показателем точности нацеливания на мишень. Нагрев можно усилить, чтобы разрушить мишень и устранить тремор без хирургического вмешательства.

Все описанные выше воздействия вызывают необратимые повреждения мозга. Благодаря нейропластичности со временем наступает компенсация нарушений, то есть выравнивание возникших вследствие повреждения патологических изменений поведения. Чтобы избежать компенсации нарушений, ученые также разработали методы, позволяющие вызвать обратимые повреждения мозга, например охлаждение головного мозга (regional cooling'), препятствующее синаптической передаче. Полую металлическую спираль подводят к определенной структуре мозга, затем через спираль пропускают охлажденную жидкость, охлаждая соответствующую мозговую структуру до 18 °C (Lomber & Payne, 1996).

После удаления охлажденной жидкости из спирали мозговая структура быстро нагревается, после чего происходит восстановление синаптической передачи. Другой метод предполагает местное введение агониста ГАМК, который тормозит эту зону, препятствуя взаимодействию соответствующей структуры мозга с другими структурами. Расщепление агониста ГАМК поворачивает процесс вспять, обеспечивая восстановление функции.

Принцип 10. Нервная система функционирует благодаря чередованию процессов возбуждения и торможения.

2. Стимуляция мозга. Мозговая деятельность предполагает использование как электрической, так и химической энергии, что делает возможной селективную активацию или инактивацию областей мозга посредством электрической или химической стимуляции. В середине XX в. Уайлдер Пенфилд (Wilder Penfield) впервые применил электростимуляцию коры больших полушарий человека во время операции на мозге. Позднее исследователи стали использовать стереотаксисы для подведения электродов или канюль к специфическим точкам в мозге. Основная задача исследователей состояла в стимуляции или блокировке нейронной активности, а также в наблюдении за соответствующими поведенческими эффектами.

Пожалуй, самым ярким примером исследования с применением электростимуляции, является эксперимент по стимуляции специфических участков гипоталамуса. Крысы с электродами, вживленными в латеральный гипоталамус, едят все время, пока идет стимуляция. Если животное имеет возможность нажимать на рычаг, обеспечивающий подачу тока в течение непродолжительного времени, оно быстро научается включать ток — такое поведение называют самостимуляцией. По-видимому, электростимуляция воздействует на центр, одновременно отвечающий за голод и удовольствие.

Электростимуляция мозга может быть использована в терапевтических целях. Например, стимуляция расположенных поблизости от пораженной инсультом зоны интактных корковых зон способствует восстановлению двигательных функций (см. рис. 4). Кэм Тески (Cam Teskey) и его коллеги (Brown et al., 2011) сумели достичь успеха в восстановлении двигательных функций у модельных крыс с болезнью Паркинсона благодаря электростимуляции специфического мозгового ядра.

Глубинная стимуляция мозга (DBS) — это метод хирургического лечения. Имплантированные в мозг электроды подают импульсный ток низкого напряжения в целевую область мозга, обеспечивая коррекцию поведения. Глубинную стимуляцию мозга применяют для воздействия на подкорковые структуры. Например, стимуляция бледного шара в базальных ядрах пациентов с болезнью Паркинсона делает движения пациентов более плавными, зачастую позволяя существенно уменьшить количество принимаемых ими препаратов. Глубинная стимуляция нескольких областей мозга была одобрена как метод лечения обсессивно-компульсивного расстройства.

В настоящее время проводятся исследования, направленные на определение оптимальных областей мозга, глубинная стимуляция которых может быть использована для лечения таких трудноизлечимых заболеваний, как большое депрессивное расстройство (Schlaepfer et al., 2013), шизофрения и, возможно, эпилепсия. Глубинную стимуляцию мозга также можно применять для ускорения восстановления после черепно-мозговых травм.

Электростимуляция мозга относится к инвазивным методам: в черепе необходимо просверлить отверстие, чтобы ввести в мозг электрод. Взаимосвязь между магнетизмом и электричеством позволила ученым создать неинвазивный метод, называемый транскраниальной магнитной стимуляцией (ТМС). Во время процедуры к черепу пациента подводят индуктор (небольшую катушку из медного провода — см. рис. 7, А). Подаваемый на катушку импульсный ток высокого напряжения обеспечивает создание импульсного магнитного поля. Магнитное поле легко проникает сквозь череп, вызывая деполяризацию нейронов коры больших полушарий и обеспечивая их возбуждение (рис. 7, Б).

Рисунок 7. Транскраниальная магнитная стимуляция. А. При лечении депрессии ТМС влияет на нейронную активность в локальной области. Б. Комбинированный снимок демонстрирует эффект ТМС

Стимуляция моторной коры вызывает двигательный ответ; стимуляция во время движения приводит к подавлению двигательного ответа. Аналогичным образом, при стимуляции зрительной коры испытуемый видит световые точки (фосфены). Эффект ТМС в форме коротких импульсов сохраняется только на время стимуляции, однако многократная ТМС или непрерывная стимуляция в течение нескольких минут обеспечивает более длительный эффект, в том числе изменение функции или обратимую инактивацию тканей. ТМС и многократную ТМС можно использовать для изучения связи между мозговой деятельностью и поведением у здоровых испытуемых. Многократную ТМС также рассматривают в качестве потенциального метода лечения поведенческих расстройств. Также были получены доказательства антидепрессивного эффекта ТМС.

3. Воздействие с помощью препаратов. Мозговую активность также можно стимулировать путем введения препаратов в кровь или непосредственно в специфические структуры мозга с помощью имплантируемых канюль (см. рис. ниже). Препараты могут влиять на активность специфических нейронов в определенных отделах мозга. Например, введение здоровым крысам применяемого для лечения шизофрении препарата галоперидола снижает активность дофаминергических нейронов, вызывая каталепсию и снижение двигательной активности (гипокинезию).

Микродиализ.

Введение крысам повышающих активность дофаминергических нейронов препаратов, таких как амфетамин, напротив, приводит к гиперактивности. Преимущество применения препаратов состоит в том, что со временем их воздействие сходит на нет благодаря метаболизации. Это дает ученым возможность изучить воздействие препарата на приобретенное поведение, например на выполнение сложных движений (см. рис. 4), а затем провести повторное исследование поведения после прекращения действия препарата.

Клаудия Гонсалес и ее коллеги (Claudia Gonzalez, 2006) вводили крысам никотин, когда обучали их доставать пищу через узкую щель, а затем оценивали приобретенный крысами навык. Исследователи установили, что введение никотина на ранних этапах обучения ухудшало усвоение двигательного навыка на более поздних этапах. Это открытие удивило ученых. Похоже, что многократный прием психостимуляторов, таких как амфетамин, кокаин и никотин, может оказывать долгосрочное воздействие на пластичность мозга (способность мозга меняться под воздействием опыта), в т. ч. на обучение выполнению специфических задач.

4. Генетические манипуляции и возможность их комбинирования с воздействием света и препаратов. В течение последних двух десятилетий возникло новое направление — синтетическая биология, предполагающая создание не имеющих аналогов в природе биологических систем. Синтетическая биология предоставила нейробиологам новые методы, позволяющие манипулировать клетками мозга. Эти методы предполагают внедрение нуклеотидной последовательности в геном живого организма или удаление нуклеотидной последовательности из генома.

Новая технология, известная под названием CRISPR—Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), — это один из множества методов, основанных на использовании системы CRISPR, которую бактерии используют для защиты от вирусов. Система CRISPR представляет собой универсальный инструмент для разрезания ДНК любых клеток. Ученые применяют бактериальный белок Cas9 вместе с последовательностью РНК, которая соответствует подлежащему удалению из генома фрагменту ДНК. Это позволяет использовать систему CRISPR для подавления одного или нескольких генов путем вырезания соответствующих фрагментов ДНК. Систему репарации ДНК можно использовать, чтобы вставить новую последовательность на место вырезанного фрагмента.

Значение технологий CRISPR сложно переоценить. При использовании в качестве инструмента для исследования они позволяют ответить на следующий вопрос: какова связь между геном (генами) и специфической формой поведения? Применение технологий CRISPR в терапевтических целях в конце концов может привести к исчезновению многих наследственных заболеваний. Технологии CRISPR могут быть использованы для решения проблемы антибиотикорезистентности, борьбы с паразитами и обеспечения безопасности пищевых продуктов.

Другая трансгенная технология, оптогенетика, предполагает применение генетических методов и облучения светом для регуляции функции клеток живой ткани. Последовательность, кодирующая связанный с ионным каналом светочувствительный белок, позволяет ученым использовать свет для изменения конформации ионного канала.

Оптогенетика появилась благодаря открытию способности света активировать некоторые встречающиеся в природе белки, которые могут быть внедрены в клетки модельных организмов. Например, выделенные из микроорганизмов белки опсины содержат связанный с ионным каналом светочувствительный домен (рис. 8). Первым стали применять светочувствительный белок ченнелродоп-син-2 (ChR2). При облучении экспрессируемого в нейронах ChR2 синим светом ионный канал открывается, мгновенно деполяризуя нейрон и вызывая его возбуждение. Воздействие на галородопсин (NpHR) зелено-желтым светом, напротив, приводит к активации хлорного ионного насоса, гиперполяризации нейрона и торможению. С помощью оптоволокна можно облучать отдельные области мозга, чтобы вызвать мгновенный ответ генетически модифицированных нейронов (Haubensak et al., 2010).

Рисунок 8. Облучение нейронов. Преимущества оптогенетики — это высокое временнбе разрешение при управлении возбуждением нейронов и обратимость воздействия. Свет с определенной длиной волны активирует экспрессируемые в нейронах светочувствительные белки. Слева внизу показано, что облучение клетки с внедренным белком ChR2 синим светом приводит к резкому повышению уровня возбуждения. Справа показано, что облучение клетки с внедренным белком NpHR зелено-желтым светом приводит к резкому снижению уровня возбуждения

Оптогенетика как метод исследования обладает огромным потенциалом. Исследователи могут внедрять светочувствительные белки в нейроны определенных типов, например в пирамидные нейроны области СА1 гиппокампа, и использовать свет для избирательной активации клеток выбранного типа. Причиной популярности оптогенетики является высокое пространственное и временное разрешение. Ионные каналы можно внедрить в определенные клеточные линии; их активация и инактивация может происходить в миллисекундных временных масштабах. Оптогенетику также можно применять для исследования поведения. Например, миндалевидное тело — это основная структура, отвечающая за страх у млекопитающих.

Если в нее внедрить опсины, а затем подвергнуть воздействию обеспечивающего торможение света, крысы не испугаются и будут свободно бродить в новом для них открытом пространстве. Сразу после выключения света они бросятся в укрытие.

Трансгенные технологии, известные как хемо-генетические методы, предполагают внедрение синтетической нуклеотидной последовательности, кодирующей связанный с G-белком рецептор, который реагирует исключительно на специально разработанный синтетический низкомолекулярный препарат. Наиболее известным является метод DREADD (Designer Receptor Exclusively Activated by Designer Drugs). Главное преимущество метода состоит в том, что препарат активирует только генетически модифицированный рецептор, а активацию рецепторов вызывает только специально разработанный препарат, а не эндогенные молекулы (Wess et al., 2013). Это говорит о высокой специфичности метода, однако его временное разрешение существенно ниже, чем у оптогенетики, поскольку активацию рецепторов обеспечивают препараты, а не облучение светом.

е) Контрольные вопросы по оценке освоения материала. Прежде чем продолжить, проверьте себя.
1. Поведенческая нейробиология изучает связь между _________ и _________.
2. Исследование анатомии предполагает применение таких методов, как посмертное _________ тканей и визуализация живых тканей с помощью.
3. Новейший метод изучения поведения грызунов основан на использовании автоматизированной _________, которая позволяет снизить вариабельность поведения и стресс, связанный с присутствием человека при тестировании.
4. Расскажите о различных методах стимуляции мозга, обеспечивающих увеличение или подавление активности нейронов.

ж) Ответы на контрольные вопросы:
1. В любом порядке: мозговой деятельностью; поведением.
2. Гистологическое исследование; мультифотонной микроскопии.
3. Устройство с сенсорным экраном.
4. К методам стимуляции мозга относятся: электростимуляция, глубинная стимуляция мозга; транскраниальная магнитная стимуляция (ТМС); использование фокусированного ультразвука высокой интенсивности (HIFU); химические вещества (препараты); трансгенные технологии: оптогенетика (применение света), хемогенетические методы (использование синтетических препаратов для взаимодействия исключительно с целевыми рецепторами) и методы генной инженерии (к примеру, технологии CRISPR-Cas9).

Видео операция лоботомия: история, показания, последствия

- Читать далее "Измерение электрической активности мозга"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 23.8.2023