Далее мы кратко остановимся на основных результатах «чернового» сиквенса генома человека, которые, как уже указывалось, были опубликованы в февральском номере журнала «Nature» за 2001 г. Они представляют собой результат деятельности международного консорциума по сиквенсу генома человека, в который вошли 20 исследовательских групп из США, Великобритании, Японии, Франции, Германии и Китая.

Понятие «черновой вариант» прежде всего относится к тому факту, что сиквенс не непрерывен — в нем имеются бреши.

Поскольку таких брешей достаточно много, то невозможно расположить по порядку и ориентировать многие мелкие секвенированные последовательности.

Неполнота сиквенса, естественно, пока создает проблемы для идентификации генов наследственных болезней, уникальных генов и других генетических структур.

Следует отметить, что за последнюю четверть XX в. были секвенированы геномы 599 вирусов и вироидов, 205 плазмид, 185 органелл, 31 эубактерии, 1 вида грибов, 2 видов животных и несколько других геномов. Опыт, накопленный в результате этой работы, был в полной мере использован при секвенировании генома человека.

Стратегия сиквенса генома человека в общественном проекте включала в себя получение генетической и физической карты генома человека, последующее введение в эти карты результатов сиквенса отдельных клонов геномной ДНК (стратегия сиквенса «клона за клоном»). Такой подход, по мнению организаторов программы, позволяет избежать ошибок в сиквенсе, особенно в областях повторов.

Физическая карта человеческого генома имеет клепальную основу, которая была разработана Olson еще в 1981 г. Подход заключается в следующем. Геном разрезался на сегменты, содержащие по 150 000 п.н., с помощью частичного переваривания сайтспецифическими эндонуклеазами. Эти большие сегменты ДНК помещали в искусственные бактериальные хромосомы (ВАС) и вводили в бактерии, где они копировались при каждом делении бактерии. В результате образовались клоны идентичных молекул ДНК.

Таких клонов, перекрывающих геном человека, должно быть примерно 20 000. Каждый клон полностью переваривался рестрикционной эндонуклеазой, отобранной для получения характерного паттерна малых фрагментов, или фингерпринта клона.

Сравнение паттернов сайтов рестрикции позволяло обнаружить перекрывание между клонами, что дало возможность установить их взаимное расположение и выстроить по порядку. Кроме того, для установления порядка клонов использовали ранее разработанные карты STS (см. выше). В результате получилась физическая карта генома.

Отдельные ВАС-клоны разрезались на фрагменты и клонировались. Полученные в результате клонирования фрагментов субклоны секвенировали. Каждый раз сек-венировали большое число одинаковых субклонов, чтобы быть уверенным в том, что каждый фрагмент оригинального ВАС-клона проанализирован несколько раз и при этом не допущено ошибок.

Сиквенсы отдельных фрагментов объединяли с тем, чтобы получить последовательность нуклеотидов в каждом исходном ВАС-клоне. Наконец, сиквенс всего генома собирали путем соединения сиквенсов набора ВАС, перекрывающих весь геном.

Созданная таким образом карта сиквенса генома человека имеет более 1000 разрывов. Это может быть связано с рядом причин, в частности с тем, что исходные ВАС-клоны не перекрывали весь геном, а также перекрывание между клонами было пропущено из-за присутствия крупных повторов в геноме. Созданная в результате реализации проекта карта сиквенса включает последовательности, содержащие в среднем несколько миллионов пар нуклеотидов в длину.

Сегменты такой длины достаточны, чтобы карту, основанную на клонах, наложить на другие карты с меньшим разрешением. Для этого была использована FISH-гибридизация in situ ВАС-клонов. Положение на генетической карте секвенированных последовательностей определяли также относительно картированных STS.

В общем секвенировано и собрано с помощью компьютерных программ в протяженные участки около 90 % эухроматиновых районов генома. Законченным, однако, можно считать сиквенс только для приблизительно 1/4 генома, в котором каждая пара оснований секвенирована в среднем 8—10 раз (предполагают, что такое количество повторов сиквенса каждого нуклеотида будет достигнуто в окончательном сиквенсе для всего генома человека). Несмотря на неполноту сиквенса, целый ряд полученных с его помощью результатов уже сейчас представляет несомненный интерес. Это относится в первую очередь к углублению наших глобальных представлений об организации генома человека.

- Читать далее "Особенности организации генома человека. Паразитические повторы ДНК."