Подготовка к анализу. Приготовление элюента. 0,05 М раствор углекислого аммония (4,8045 г/1000 мл воды) смешивали с ацетонитрилом в соотношении 65 : 35 и фильтровали через бумажный фильтр непосредственно перед использованием.

Настройка хроматографа. Для ввода хроматографической системы в рабочий режим колонку LUNA С 18 (250 х 4,6 мм) промывали элюентом в количестве 15 свободных объемов колонки при скорости протекания элюента 0,3 см3/мин. После окончательного уравновешивания колонки устанавливали УФ-волну анализа на 290 нм.

Приготовление рабочих стандартных растворов. На аналитических весах взвешивали по 10,0 мг (точные навески с учетом активности) фенбендазола и оксфендазола, навески переносили в общую мерную колбу объемом 100 см3, добавляли 50 см3 элюента и тщательно перемешивали до полного растворения. Затем объем раствора водой доводили до метки. Полученная концентрация исходного раствора - 100 мкг/см3 по каждому из компонентов. Из исходного раствора методом последовательных разведений готовили стандартные растворы с концентрацией 10; 5; 2,5 и 1 мкг/см3 по фенбендазолу и оксфендазолу.

Подготовка проб к анализу. В образцы (плазма крови, печень, почки, сердце, поджелудочная железа, легкие, селезенка, мышечная ткань, жировая ткань, лимфоузлы, матка, тонкий и толстый кишечник) массой 5 г добавляли 10 см3 физиологического раствора и гомогенизировали в течение 3-5 мин при 5000 об/мин.

Полученный гомогенат количественно переносили в делительную воронку и помещали в резервуар со льдом. В охлажденный гомогенат вносили 2 г бромида калия и титровали рН до 8-9 при помощи 25%-ного водного аммиака, после чего пробу тщательно перемешивали. Далее, к гомогенату добавляли 10 см этилацетата, пробу экстрагировали при постоянном перемешивании в течение 1 ч. Затем для разделения слоев полученную эмульсию центрифугировали в течение 5 минут при 5000 об/мин.

Экстракцию каждой пробы этилацетатом с последующим центрифугированием проводили трехкратно. После центрифугирования слои этилацетата переносили в круглодонную колбу для последующего упаривания. Объединенные этилацетатные экстракты упаривали досуха на ротационном испарителе при температуре +40 °С. Полученный после упаривания сухой остаток растворяли в 10 см3 ацетонитрила при одновременной обработке ультразвуком. Ацетонитрильный раствор переносили в пробирку объемом 25 см3 и промывали 3-5-кратно порциями по 8 см гексана.

Гексановые фракции отбрасывали, а ацетонитрильную фракцию, промытую гексаном, переносили в круглодонную колбу объемом 50 см3 и упаривали досуха на ротационном испарителе при температуре +50°С. Полученный после упаривания сухой остаток растворяли в 0,5 см3 элюента при одновременной обработке ультразвуком для последующего анализа методом жидкостной хроматографии высокого давления.
Параметры хроматографирования. Наиболее оптимальные результаты анализа были получены при следующих хроматографических параметрах:

Обращеннофазовая хроматографическая колонка LUNA С 18 (250 х 4,6 мм) с диаметром сорбента 5 мкм. Элюент: ацетонитрил/0,05 М раствор углекислого аммония в соотношении 35/65. Скорость протекания элюента - 0,5 см/мин. Давление: 18,4 МПа. Объем вводимой пробы - 50 мкл. Спектр УФ-волны: 290 нм.

Определение метрологических характеристик метода. Для проведения качественного и количественного анализа полученных экстрактов применяли процедуру градуировки хроматографических данных, в компьютерной программе «Мультихром 1.5».

Для построения графика корреляции площади пика и концентрации использовали ряд стандартных разведений фенбендазола и оксфендазола 10; 5; 2,5 и 1 мкг/см , приготовленных по схеме, приведенной выше.

Уравнения, полученные для линий тренда фенбендазола и оксфендазола, и в частности, величины достоверности аппроксимации (R2), приближенные к единице, свидетельствуют о высокой степени линейной зависимости площади пика от концентраций компонентов и, следовательно, о высокой достоверности получаемых результатов.

Определение уровня извлечения фенбендазола и оксфендазола из проб. Определение уровня извлечения фенбендазола и оксфендазола проводили на контрольных пробах. В плазму крови объемом 2 см3, а также гомогенаты проб органов и тканей массой 5 г вносили по 1 см3 стандартного раствора фенбендазола и оксфендазола с концентрацией 5 мкг/см3. После внесения стандартных растворов пробы тщательно перемешали. Пробоподготовку проводили по отработанной методике. Объем конечных экстрактов модельных проб составлял 1 см3.

Определение пределов детектирования. Пределы детектирования фенбендазола и оксфендазола в экстрактах определяли хроматографированием модельных проб плазмы крови, печени, почек, сердца, поджелудочной железы, легких, селезенки, мышечной ткани, жировой ткани, лимфоузлов, матки, тонкого и толстого кишечника с внесенными стандартными образцами различной концентрации.

- Читать далее "Определение инвермектинов в тканях. Авермектин в тканях"