Возбудитель коклюша (Bordetella pertussis): морфологические, культуральные, биохимические свойства

Коклюш — острая антропонозная инфекционная болезнь с воздушно-капельным механизмом передачи, характеризующаяся своеобразным спазматическим кашлем, поражением дыхательной, сердечно-сосудистой и нервной систем.

Впервые коклюш был описан в 1578 г. G. de Bailou во время эпидемии этого заболевания в Париже, сопровождавшейся высокой летальностью. Через 100 лет, в 1678 г., тяжелую эпидемию коклюша в Лондоне наблюдал Willis. Им подмечены наиболее характерные клинические особенности этого заболевания. Более подробно описание клинического течения коклюша было сделано Sydengam на основании изучения эпидемий коклюша в Англии в период 1670-1679 гг.

В дальнейшем упоминания о коклюше встречаются в литературе более часто. Название болезни «коклюш» (от франц. — coqueluche; лат. название — pertussis) появилось в 1724 г., когда эпидемии этого заболевания наблюдались в Англии, Франции и Австрии.

В отечественной литературе первое упоминание о коклюше встречается у Н. Максимовича-Амбодика в его труде «Искусство повивания» (1784). Клиническая картина коклюша впервые была описана русским педиатром С.Ф. Хотовицким (1796-1885) в его книге «Педиятрика», опубликованной в 1847 г.

В России систематические сведения о заболеваемости и смертности, в том числе и при детских инфекционных заболеваниях, впервые появляются в печати с 70-х it. XIX века, когда были организованы земства и начали издаваться работы по санитарии и санитарной статистике. Большое значение в исходах коклюша имели социальные факторы, основными из которых были материальная необеспеченность и плохие жилищные условия. В эти годы коклюш занимал первое место среди четырех воздушнокапельных инфекций (кори, скарлатины, дифтерии). Снижение смертности от коклюша произошло лишь в 50-е годы прошлого столетия. Решающую роль в проблеме коклюша сыграла специфическая профилактика, которая в нашей стране впервые была введена в широкую практику в 1958-1960 гг. Специфическая профилактика коклюша привела к резкому снижению заболеваемости, снижению тяжести болезни, а также повлияла на изменение токсических свойств возбудителя.

Наблюдение за развитием эпидемического процесса, клиникой и свойствами возбудителя коклюша убедило, что достигнутые при помощи вакцинопрофилактики успехи могут быть обратимыми. Отказ от профилактики в ряде стран привел к резкому подъему заболеваемости, высокой летальности. Рост заболеваемости и смертности от коклюша в странах, отказавшихся от вакцинации, явился решающим аргументом, прекратившим многолетнюю дискуссию ученых многих стран: для всех стало очевидно, что вред здоровью ребенка, наносимый коклюшем, значительно превышает риск поствакцинальных осложнений.

В изучение особенностей патогенеза, клинического течения, профилактики и лечения коклюша большой вклад внесли отечественные педиатры — Н.Ф. Филатов, Н.П. Гундобин, А.А. Кисель, М.Г. Данилевич, А.И. Доброхотова.

Возбудитель коклюша — Bordetella pertussis был открыт в 1906 г. Борде (J.Bordet) и Жангу (O.Jengou), однако многие его фено- и генотипические свойства оставались неизученными. Только необходимость создания бесклеточной вакцины, менее реактогенной, чем корпускулярная, ускорила получение новых данных об антигенной структуре и факторах патогенности B.pertussis, их роли в развитии болезни и формировании иммунитета. Начиная с 80-90-х гг. прошлого столетия появилась возможность разработки новых современных методов лабораторной диагностики, однако до сих пор такие методы в практическом здравоохранении в нашей стране отсутствуют.

а) Морфологические, культуральные, биохимические и прочие физиологические свойства. Возбудитель коклюша — Bordetella pertussis относится к роду Bordetella, который включает также другие виды микроорганизмов — В. parapertussis, В. bronchiseptica, В. avium, В. holmesii, В. hinzii. Два последних вида описаны недавно — в 1994-1995 гг. В. pertussis, В. parapertussis и В. bronchiseptica имеют близкие генетические связи (G+C— от 66 до 70 моль%; гомология ДНК B.pertussis и В.parapertussis — 88-94%, В. pertussis и В. brochiseptica — 72-93%). Мультилокусный энзимный анализ, позволяющий устанавливать генетическую близость, почти не выявляет генетических различий между этими видами. Однако фенотипические различия существуют (морфология, характер роста, потребления азота, биохимические реакции). Генетические исследования, проведенные в нашей стране в 70-е гг. прошлого века М.С. Захаровой, а также в Японии и США, показали, что можно получить мутанты коклюшных бактерий, подобных паракоклюшным; кроме того, установлено, что паракоклюшный микроб лизируется коклюшным фагом. Эти данные дали основание отнести B.parapertussis к подвиду В. pertussis. Таким образом, некоторые исследователи считают их одним видом или подвидами внутри одного вида. Но большинство исследователей не согласны с этой точкой зрения. Так, B.avium является отдельным видом, имеющим G+C 62 моль%. В. pertussis, В. parapertussis и В. bronchiseptica были выделены в отдельный самостоятельный таксон — род Bordetella в 1952 г. (с 1920 г. эти микроорганизмы входили в род Haemophilus, с представителями которого имеют лишь внешнее морфологическое сходство, а фено- и генотип разные). Предполагалось, что наряду с представителями рода Alcaligenes род Bordetella следует включить в новую семью Alcaligenaceae (1986).

Все представители рода Bordetella — респираторные патогены теплокровных животных и человека, имеющих тропизм к эпителиальным силиальным (реснитчатым) клеткам. В. pertussis вызывает заболевание коклюшем у человека. До недавнего времени В. parapertussis считали исключительно человеческим патогеном, однако в 1994 г. он был выделен от здоровых и больных пневмонией ягнят. В. brochiseptica вызывает заболевание преимуществен но у домашних животных, например, трахеобронхит у собак. В. bronchiseptica является оппортунистическим патогеном у человека при респираторных (бронхите и пневмонии) и других инфекциях (бактериемия, инфекция ран, эндокардит, менингит, перитонит). Некоторые из этих инфекций возникают при контакте с животными. Однако возникновение коклюша не связано с В. bronchiseptica. В. avium вызывает ринотрахеит у птиц (индеек). Выделение В. avium у человека не зафиксировано. В. holmesii выделена из крови пациентов с нарушениями функций иммунной системы, два штамма — из слюны и крови больного СПИДом, а также из дыхательных путей индеек и цыплят. Эти штаммы оказались сходными с В. avium. Еще в 1986 г. было установлено родство В. avium с микроорганизмами рода Alcaligenes (A. faecalis), что может привести к ошибкам при идентификации. Поэтому последние случаи выделения микроорганизмов видов B.holmesii или B.avium от человека требуют доказательств правильности их идентификации.

1. Морфологические свойства. Микроорганизмы рода Bordetella — маленькие грамотрицательные коккобациллы или короткие мелкие палочки размером от 0,2-0,5 до 0,5-2,0 мкм. В. pertussis имеет вид коккобактерий со слегка удлиненным одним диаметром; В. parapertussis — ярко выраженная палочковидная бактерия, так как ее продольный диаметр в 2 раза длиннее поперечного. Размер клеток В. pertussis: продольный диаметр — 0,6-1,3 мкм, поперечный — 0,5-1,0 мкм, а В. parapertussis: продольный диаметр — 0,8-2,0 мкм, поперечный — 0,6-1,5 мкм.

Клетки располагаются по одиночке или группами, имеют нежную капсулу, с трудом выявляемую простыми методами окраски. Чтобы ее увидеть, необходимо окрасить по Романовскому-Гимзе; лучшему выявлению способствует культивирование в неблагоприятных условиях (например, в присутствии иммунной сыворотки). Палочки неподвижные (В. pertussis и В. parapertussis) или подвижные (В. bronchiseptica, В. avium), спор не образуют.

В. pertussis, В. parapertussis и В. bronchiseptica хорошо окрашиваются всеми анилиновыми красками. Предпочтительнее использовать толуидиновый синий, выявляющий метахроматические гранулы, которые обусловлены неравномерным распределением липидов в клетке.

Микроорганизмы рода Bordetella — облигатные аэробы с оптимальной температурой роста 35-37°С. Они являются в большей мере метаболически неактивными и не производят кислоты из углеводов.

2. Культуральные свойства. В отношении питательных сред бордегеллы отличаются высокой требовательностью. Для оптимального роста культур необходимо присутствие различных аминокислот, а также никотиновой кислоты, различных солей и др. В. pertussis утилизируют 2-аминоглутаровую, аспарагиновую и аминоэтановую аминокислоты, серин, треонин, аланин и пролин. В. parapertussis способны расщеплять те же аминокислоты и дополнительно аргинин.

В. pertussis наиболее требовательны к питательным средам, им необходимы комплексы факторов роста. Свежие клинические изоляты не могут расти на «шоколадном» агаре или обычной агаровой среде с 5% крови овцы. Более того, некоторые субстанции, включая жирные кислоты, ионы тяжелых металлов, сульфиды и пероксиды, ингибируют рост В. pertussis. Среды для первичного выделения В. pertussis в основном включают крахмал, древесный уголь, ионообменные смолы или большое количество крови, чтобы инактивировать ингибирующие вещества. В. parapertussis несколько менее требовательны, чем В. pertussis, но выделение из клинических проб обычно выполняется только тогда, когда используется специализированная среда для В. parapertussis. В. bronchiseptica и В. avium, как правило, нетребовательны, могут быть выявлены на обычных лабораторных агарах, включая агары с кровыо или без нее.

В настоящее время основными питательными средами для выделения В. pertussis являются картофельно-глицериновый агар с кровью (среда Борде—Жангу), казеиновоугольный агар (КУА) и угольно-кровяной агар (среда Regan—Lowe, применяемая за рубежом). Раньше использовали также молочно-кровяной агар. Оптимальным считается добавление в среду лошадиной или бараньей крови; использование человеческой крови дает худшие результаты. В качестве ингибитора роста посторонней микрофлоры применяют бензилпенициллин. Однако часть штаммов В. pertussis чувствительна к данному антибиотику, что приводит к снижению высеваемости. Для предотвращения этого эффекта используют уменьшенную дозу антибиотика. За рубежом вместо бензилпенициллина применяют цефалексин, а для подавления грибковой флоры — амфотерицин В.

Рост В. pertussis на питательных средах обнаруживается через 48-72 ч. Для В. parapertussis и В. bronchiseptica характерна высокая интенсивность размножения; они хорошо растут на всех средах, поэтому их рост виден уже через 24 ч, при регистрации результата через 72 ч у данных микроорганизмов колонии более крупные, чем у В. pertussis. На кровяном агаре колонии всех бактерий рода Bordetella появляются в виде мелких блестящих непрозрачных с ровными краями выпуклых перламутровых образований, напоминающих капельки ртути; для В. parapertussis характерен даже металлический оттенок. На молочно-кровяном агаре колонии В. pertussis и В. parapertussis плоские серовато-белого цвета. Бактерии рода Bordetella обладают способностью гемолизировать эритроциты, однако величина и характер зоны гемолиза вокруг колоний зависит от вида крови, ее концентрации, а также от состава питательной среды. Ясно выраженная зона гемолиза у данных микроорганизмов отмечается и на казеиново-угольном агаре с кровыо. На КУА колонии также выпуклые круглые с ровными краями серовато-голубоватого цвета. При стереоскопической микроскопии можно наблюдать узкий луч света — «хвостик», отходящий от центра колонии. Этот признак наиболее четко выражен у В.pertussis.

В стереоскопическом микроскопе колонии В. pertussis однородные, гладкие без пигмента, не имеют зернистости. Для В. parapertussis характерно наличие колоний с зернистым строением, приподнятым центром и чаще с пигментом, придающим колонии розоватый или зеленоватый оттенок (особенно отчетливо это видно через 72 ч выращивания). Следует отметить, что колонии В. pertussis и В. parapertussis, особенно на казеиновых средах с кровью и углем, — влажные, мягкой консистенции и очень легко снимаются.

В. parapertussis, в отличие от В. pertussis и В. bronchoseptica, обладает способностью изменять цвет некоторых питательных сред. Так, при росте на кровяных средах и КУА происходит потемнение или побурение среды, приобретает коричневый цвет мясопептонный агар с тирозином. Это связано с тем, что В. parapertussis имеет фермент тирозиназу, который расщепляет находящийся в среде тирозин с образованием меланиноподобного пигмента.

Необходимо подчеркнуть, что при просмотре через обычный микроскоп часто трудно отличить В. pertussis от В. parapertussis по морфологическим признакам, поэтому для дифференциации этих микроорганизмов должен быть использован весь комплекс дифференциально-диагностических средств.

В жидких средах микроорганизмы рода Bordetella растут при добавлении к ним крахмала (0,15%). Предпочтительнее вместе с крахмалом использовать активированный уголь для адсорбции ненасыщенных жирных кислот, тормозящих рост микроорганизмов. Углекислота в атмосфере способствует росту при ее концентрации от 0,3 до 10%. При более высокой концентрации рост В. pertussis задерживается. Уровень pH среды должен быть в пределах 7,6-7,8.

В. pertussis растут только на мартеновском бульоне с крахмалом и углем, единичные штаммы могут давать слабый рост на мартеновском бульоне с крахмалом и без угля. В. parapertussis культивируются на сахарном бульоне, мартеновском бульоне с крахмалом (и без него) и углем. При этом ввиду высокой интенсивности размножения B.parapertussis всегда дают обильный рост.

В жидкой питательной среде микробы рода Bordetella сначала растут в виде поверхностной пленки, затем на дне образуется густой слизистый осадок, поднимающийся при встряхивании пробирки в виде слизистой нити. Кроме того, В. parapertussis вызывают легкое равномерное помутнение питательной среды, тогда как при росте В. pertussis среда остается прозрачной.

Возбудитель коклюша (Bordetella pertussis): морфологические, культуральные, биохимические свойства

3. Биохимические свойства. В. pertussis, В. parapertussis и В. bronchiseptica обладают низкой ферментативной активностью: не образуют индола, не свертывают молоко, не разжижают желатин, не ферментируют сахаров, не восстанавливают нитраты в нитриты (В. bronchiseptica редуцируют нитраты в нитриты). Особенно биохимически малоактивна В. pertussis. B.parapertussis обладает большей ферментативной активностью по сравнению с В. pertussis. Все микроорганизмы рода Bordetella обладают ферментами каталазой, гиалуронидазой, коагулазой (коагулируют плазму крови животных). В. pertussis обладает ферментом оксидазой, которая отсутствует у других видов Bordetella. Эти микроорганизмы не способны использовать глюкозу как источник энергии. Полагают, что это связано с тем, что микробы лишены энзима гексокиназы, а нерасщепленная глюкоза не может проходить через их клеточную мембрану.

Наиболее отчетливо В.pertussis и B.parapertussis можно дифференцировать по способности последней вырабатывать фермент уреазу, наличие которого определяется в пробе Закса (индикатор фенолово-красный) или при посеве на скошенный агар с мочевиной (двойной индикатор — Андреде и тимолово-синий). В. pertussis ферментом уреазой не обладает и поэтому мочевину не разлагает.

б) Устойчивость к факторам внешней среды и антибиотикам. Микроорганизмы рода Bordetella малоустойчивы к факторам внешней среды, чувствительны к ультрафиолетовым лучам и ко всем современным дезинфицирующим средствам в обычных концентрациях (3-5%). При температуре 50-55°С погибают в течение 15-20 мин, при высыхании — в течение нескольких часов.

Достаточно хорошо изучено отношение В. pertussis к антибиотикам iu vivo. В. pertussis чувствительны к эритромицину и другим макролидам (рокситромицин, макропен, азитромицин и др.), а также ампициллину и другим препаратам, в состав которых входит ампициллин (амоксициллин, амоксиклав, флемоксин и др.). Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) эритромицина для В. pertussis 0,03-0,25 мг/мл. При определении МИК у большого количества штаммов В. pertussis в 90% случаев она составляет <0,12 мг/мл. Описаны единичные штаммы В. pertussis, устойчивые к эритромицину.

в) Биологические модели. Биологических моделей для воспроизведения заболевания коклюшем нет. Вместе с тем, при изучении вирулентности штаммов B. pertussis определяют DL50 при интраназальном и внутримозговом заражении мышей, дермонекротические свойства культуры — при внутри кожном и токсичность — при внутрибрюшинном введении мышам.

г) Иммунитет. При коклюше как токсин-опосредованной инфекции важная роль в защите принадлежит гуморальному звену иммунитета. В начале заболевания защитную роль играют антитела, ингибирующие прикрепление и колонизацию микроорганизмов на эпителии верхних дыхательных путей, а затем формируется антитоксический иммунитет при помощи антител класса IgA, IgM и IgG. Антитела класса IgA, по мнению ряда исследователей, свидетельствуют о колонизации В. pertussis слизистой оболочки дыхательных путей и, таким образом, являются маркером острого процесса. В некоторых случаях IgA могут сохраняться в течение длительного периода времени. Антитела класса IgM обычно выявляются только на первой стадии заболевания. Антитела класса IgG формируются на более поздних стадиях заболевания коклюшем и сохраняются длительный период времени.

При инфицировании отмечается значительный прирост IgG-антител к КТ и ФГА. В создании длительной невосприимчивости к коклюшу наибольшую роль играют IgA- и IgG-антитела. Новорожденные дети получают пассивно от своих матерей IgG-антитела к ряду антигенов B.pertussis. Однако, несмотря на наличие трансплацентарной передачи некоторых противококлюшных антител, новорожденные дети не защищены от заболевания коклюшем. Пассивно полученные антитела исчезают через несколько месяцев и к шестимесячному возрасту их можно обнаружить только у 4% детей.

В клеточном звене иммунитета ведущая роль принадлежит Т-лимфоцитам и макрофагам. Системный лимфоцитоз при коклюше обусловлен повышением числа всех популяций Т- и В-лимфоцитов. Однако поликтональное увеличение иммунокомпетентных клеток характерно на ранних сроках заболевания, в последующем происходит угнетение Т-супрессорного звена, которое при тяжелой и среднетяжелой формах коклюша распространяется на все субпопуляции Т-лимфоцитов за исключением незрелых их форм.

Возможность развития иммунопатологических реакций при коклюше обусловлена как депрессией Т-клеточного и фагоцитарного звена иммунной системы, так и наличием сенсибилизации организма к гистамину и другим биологически активным веществам. После перенесенного коклюша обычно остается стойкий иммунитет, и повторные заболевания наблюдаются редко.

д) Эпидемиология. Коклюш — типичная воздушно-капельная инфекция. Особенности эпидемиологии коклюша определяются рядом факторов: высокой восприимчивостью человека, трудностями диагностики в продромальном периоде болезни, длительным постинфекционным иммунитетом и малой стойкостью возбудителя вне организма человека.

Источником инфекции является больной коклюшем. Передача заразного начала осуществляется через воздух. Заразительность особенно велика в начале судорожного периода, далее постепенно снижается и к 25-му дню заболевания больной коклюшем, как правило, становится не заразен.

Коклюш не является «летучей» инфекцией. Вязкость мокроты служит препятствием для ее передачи. Сам возбудитель нестоек во внешней среде. Все это является причиной, определяющей ограниченный радиус распространения возбудителя больным коклюшем. Мимолетная встреча с больным коклюшем восприимчивого ребенка обычно кончается благополучно. Если во время кратковременного контакта больной не кашлял, заражение вообще мало вероятно. Установлено, что ранняя изоляция из детского коллектива заболевшего коклюшем нередко предупреждает распространение инфекции. Заражения коклюшем через различные предметы, бывшие в пользовании больного, не происходит вследствие очень малой стойкости возбудителя во внешней среде.

Восприимчивость к коклюшу высока: в допрививочный период индекс заразительности составлял 0,7-0,8. Та же восприимчивость сохраняется для детей в возрасте до 1 года, не получивших профилактических прививок.

Особенностью коклюша является высокая восприимчивость к нему новорожденных детей, так как трансплацентарно переносимые антитела от матери не защищают от заболевания. В противоположность распространенному мнению, что коклюшем болеют только дети, нередки заболевания и среди взрослых.

Несмотря на повышение привитости детского населения (в декретированные сроки — до 4 лет), условия для распространения коклюша сохраняются. Заболеваемость коклюшем находится на относительно высоком уровне, хотя и наметилась тенденция к ее снижению.

- Читать далее "Антигены и генетика возбудителя коклюша (Bordetella pertussis)"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 14.1.2020

Остались вопросы или замечания?

Все размещенные статьи преследуют образовательную цель и предназначены для лиц имеющих базовые знания в области медицины.
Без консультации лечащего врача нельзя применять на практике любой изложенный в статье факт.
Жалобы и возникшие вопросы просим присылать на адрес statii@dommedika.com
На этот же адрес ждем запросы на координаты авторов статей - быстро их предоставим.