Тушение флуоресценции антител с помощью гаптена не обусловлено прямым контактом гаптена с хромофором. Тем не менее существует тесная связь между сродством антител к гаптену и эффективностью тушения флуоресценции антитела. Возможно, большая часть остатков триптофана в молекуле антитела осуществляет безизлучательный переход из возбужденного в основное состояние, передавая энергию одному или нескольким остаткам триптофана в районе активного центра; последние отвечают за флуоресценцию всей молекулы.

Эффективность тушения флуоресценции зависит от числа остатков триптофана в активном центре антитела. Их число больше у антител с высокой степенью сродства к гаптену. В случае антидинитрофенильных антител различия в числе остатков триптофана в антителах высокого и низкого сродства достигают четырех остатков на моль.

Спектрофлуорометрия может быть использована для оценки взаимодействия некоторых полициклических флуоресцирующих красителей (как гаптенов) со своими -антителами. Эти соединения характеризуются свойством при переходе из водной среды в неполярное микроокруженне резко увеличивать квантовый выход флуоресценции. Примером может служить 4-аннлннонафталин-сульфонат (АНС).

При взаимодействии АНС со своими антителами интенсивность флуоресценции гаптена существенно возрастает наряду с коротковолновым смещением спектра флуоресценции. Метод очень чувствителен и позволяет регистрировать реакцию при концентрации антител 10-5 моль и ниже. При этом удается оценить связывающие свойства антител, сродство которых к лиганду порядка 102—104 М-1.

Радиоспектроскопия. Синтез стабильных нитроксидных (иминоксильных) радикалов с различными реакционноспособными группами позволил использовать их, в частности, для метки гаптенов. Нитроксидные радикалы содержат неспаренный электрон и могут быть охарактеризованы методом электронно-парамагнитного резонанса (ЭПР). Спиновая метка была впервые использована Л. Стриером и О. Гриффитом (L. Stryer, О. Griffith, 1965) для получения иминоксильных производных динитробензола.

При взаимодействии этого соединения с антидинитрофенильными антителами спектр иминоксильного радикала, полученный с помощью радиоспектрометра, изменился. Эти изменения можно было связать с уменьшением вращательной свободы радикала, наблюдаемым, в частности, при замораживании водного раствора радикала.
На основании этих данных была разработана техника оценки реакции гаптен-антитело методом ЭПР. Данные, полученные этим и другими методами, совпадают.

Рассматриваемая техника может быть использована для оценки реакции антител с самыми разнообразными гаптенами при условии, что при связывании гаптена в активном центре антитела будет происходить частичная или полная иммобилизация иминоксильной метки. Дж. Сиа и Л. Пьете (J. Hsia, L. Piette, 1969) применили метод для изучения кинетики реакции бета-азобензойной кислоты и бета-азофенилтриметиламмония с соответствующими антителами. При этом оказалось, что существует прямая зависимость между степенью сродства антител к гаптену и степенью иммобилизации метки.

- Вернуться в раздел "медицинская физиология"