Весьма удобная модификация метода равновесного диализа была предложена Г. Фаирчло и Дж. Фрутоном (G. Fairchlough, J. Fruton, 1968). Приводим краткое описание метода. В колонку с сефадексом G-25, уравновешенным раствором, содержащим гаптен (например, ди-нитрофеннллнзин), вносят порцию антител к гаптену. Для вымывания антител из колонки используют раствор гаптена той же концентрации, что и в колонке. На старте антитела связывают определенное количество гаптена и, перемещаясь в колонке, все время создают в той зоне, где находятся, инкремент концентрации гаптена. В то же время в той зоне, откуда антитела ушли, образуется отрицательный инкремент концентрации гаптена, и эта зона перемещается вслед за зоной, где находятся антитела. Перемещение зоны с отрицательным инкрементом концентрации гаптена (или «ямы») соответствует скорости гель-фильтрации гаптена. Оценив по величине отрицательного инкремента количество связанного гаптена (r), можно рассчитать константу равновесия.

Метод равновесного диализа в его различных модификациях — общепринятый способ оценки реакции антител с простыми гаптенами. Его чувствительность зависит только от чувствительности методов оценки концентрации гаптена. Наиболее чувствительным, разумеется, является радиоизотопная техника с использованием меченных радиоактивными изотопами гаптенов.
Оптические методы. С помощью оптических методов можно охарактеризовать изменения оптических свойств гаптена после образования им комплекса с антигеном.

При реакции антител с динитрофенил(тринитрофенил)лизином в спектре поглощения гаптена происходят характерные изменения. С помощью дифференциальной спектрофотометрии удается зарегистрировать длинноволновое (красное) смещение спектра поглощения нитрофенильной группы. Это явление, которое впервые наблюдали Дж. Литл и X. Анзен (J. Litle, И. Eisen, 1968), обусловлено образованием комплекса с переносом электрона между остатком триптофана в активном центре антитела и нитрофенильной группой, являющейся акцептором электрона. Хотя метод позволяет зарегистрировать взаимодействие гаптена с антителом, он мало применим для изучения кинетики реакции. Следует заметить, что степень переноса электрона, а следовательно, и характер спектра неодинаковы у антител к нитрофенильной группе от животных разных видов, что само по себе затрудняет сравнительный анализ.

Гаптены, являющиеся производными фолиевой кислоты, также образуют в активном центре комплексы с остатком триптофана по типу комплекса с переносом электрона. Акцептором электрона в молекуле гаптена выступает птеридиновая группа, а донором электрона — остаток триптофана.

Реакция гаптена с антителом может быть зарегистрирована с помощью техники спектрофлуорометрии. Как известно, флуоресценция триптофансодержащих белков обусловлена почти исключительно индольными остатками триптофана. Последние, находясь в неполярном микроокружении, флуоресцируют с максимумом при 330 нм в случае облучения белка ультрафиолетом с длиной волны 270—290 нм. Если в активном центре антитела находится гаптен, одна из полос в спектре поглощения которого совпадает с полосой поглощения триптофана, происходит тушение флуоресценции триптофана, содержащегося в молекуле антитела, а следовательно, флуоресценции собственно молекулы антитела (S. Velick et al., 1963). Такой феномен наблюдается при взаимодействии нитрофенильных гаптенов с направленными к ним антителами. Степень тушения достигает 70% для нерасщепленного антитела и 90% для его Fab-фрагмента. Чувствительность метода при использовании чистых антител очень велика: на одно определение достаточно 50 нг антител.

- Читать далее "Тушение флуоресценции антител. Спектрофлуорометрия и радиоспектроскопия"