Наиболее точный показатель неблагополучности исследуемого объекта — это наличие патогенных микроорганизмов. Однако потенциально опасные для человека микроорганизмы составляют ничтожную часть микрофлоры окружающей среды. Выделение патогенных микроорганизмов из объектов окружающей среды затруднено из-за заселенности их большим количеством сапрофитов, которые препятствуют росту патогенной микрофлоры на питательных средах. Определенные трудности связаны и с необходимостью использования сложных и трудоемких методов исследования. Серьезно осложняет процесс анализа неравномерное распределение патогенных микроорганизмов в окружающей среде.

Выделение одного возбудителя далеко не всегда свидетельствует о присутствии патогенов других видов. Кроме того, в условиях внешней среды происходят генетические процессы (мутация, трансформация, трансдукция и др.), которые приводят к изменению исходных и формированию новых признаков патогенных микроорганизмов. В последнее время ситуация в значительной мере осложняется возрастающей ролью условно-патогенных микроорганизмов в возникновении массовых заболеваний.

Присутствие того или иного патогенного микроорганизма можно ориентировочно установить путем прямой микроскопии (обычной или люминесцентной). Достаточно быстро и эффективно патогенные микроорганизмы выделяют при посеве исследуемого материала на накопительные, элективные и дифференциально-диагностические среды. Один из классических методов—заражение лабораторных животных с последующим выделением патогенного микроорганизма. Широко применяются разнообразные методы иммунодиагностики, полимеразная цепная реакция (ПЦР), гибридизация нуклеиновых кислот, реакция нарастания титра фага (РНТФ) и др. В определенной степени перспективен и автоматизированный метод мультисубстратного тестирования. К сожалению, даже современные методы не гарантируют успеха при незначительном содержании патогенов в исследуемых объектах.

Поэтому исследования на патогенную микрофлору в санитарной микробиологии проводят только по эпидемическим показаниям, и санитарно-микробиологические исследования, как правило, имеют целью не обнаружение патогенов, а поиск косвенных показателей неблагополучия объектов внешней среды, тем более что в обыденной практике чаще всего решается лишь вопрос о потенциальной вероятности заражения исследуемых объектов.

Определение общего микробного числа (ОМЧ) изучаемого объекта — наиболее часто используемый метод. ОМЧ — это цифровой показатель содержания микроорганизмов в единице массы или объема исследуемого объекта. Предполагается, что вероятность проникновения в исследуемый субстрат потенциально опасных микроорганизмов будет тем выше, чем больше окажется общая обсемененность. Кроме того, высокое ОМЧ может свидетельствовать о загрязнении объекта органическими веществами. Однако необходимо помнить, что существует ряд ограничений, не позволяющих считать этот показатель универсальным. Некоторые объекты могут содержать микрофлору, активно вытесняющую и убивающую патогенные микроорганизмы.

В этом случае микробное число может изменяться сравнительно мало, и первоочередное значение будут иметь массивность заражения и его давность. Во многих пищевых продуктах имеется обильная специфическая микрофлора, участвующая в их изготовлении (например, в кисломолочных продуктах). Такие продукты могут (и должны) иметь значительное микробное число, но при этом не представляют опасности для здоровья. Напротив, встречаются объекты, сравнительно скудно обсемененные микроорганизмами, но при этом подвергающиеся избирательному загрязнению патогенной микрофлорой (например, предметы обихода, загрязненные выделениями больных). Кроме того, для многих объектов характерны крайне неравномерная микробная обсемененность и постоянный взаимообмен микрофлорой с окружающей средой.

Таким образом, показатель общей обсемененности микроорганизмами является критерием не для всех объектов окружающей среды и служит основанием только лишь для приближенных оценок. Тем не менее этот показатель имеет определенную сравнительную ценность и поэтому достаточно широко используется в практике санитарно-микробиологических исследований. Определение общего микробного обсеменения осуществляется разными способами.

Для прямого подсчета микроорганизмов используют специальные счетные камеры Петрова-Гаузера или Гельбера. Можно пользоваться гематологическими счетными камерами. При этом для облегчения счета часто применяют красители (например, эритрозин) или флюорохромы (акридиновый оранжевый и др.). Существуют фотоэлектрические или электронные счетчики для автоматического подсчета микроорганизмов в камерах. Можно также использовать метод Разумова, заключающийся в осаждении микроорганизмов из определенного объема жидкости на мембранные фильтры и дальнейшем подсчете под микроскопом в падающем свете осевших клеток. Ряд методов основан на определении числа частиц в струе газа или жидкости; эти методы позволяют существенно повысить продуктивность исследований.

Хорошо известны импакторы, осаждающие частицы определенных размеров на улавливающие пластинки, которые затем исследуют микроскопически или фотометрически. При помощи проточных цитофлуориметров анализируют клетки в суспензии в свободной струе жидкости, пересекающей луч света (измеряются интенсивность флуоресценции, а также рассеяние света под различными углами). Использование при этом ДНК-специфичных красителей, избирательно окрашивающих живые клетки и клетки с поврежденной мембраной (4,6-диамидино-2-фенилиндол или флуоресцин диацетат и пропидий йодид соответственно), делает возможным не только прямой количественный подсчет клеток микроорганизмов, но и определение процентного содержания жизнеспособных клеток, что особенно важно при санитарных исследованиях. Разработаны и другие автоматизированные методы подсчета клеток (электростатические, фотоэлектрические и другие счетчики).

К сожалению, даже использование современной техники не позволяет считать метод прямого подсчета микроорганизмов идеальным. Часто микроорганизмы образуют более или менее крупные скопления, не всегда удается добиться полной гомогенизации исследуемых объектов, значительно осложняют подсчет примеси (особенно растительные остатки), невозможно подсчитать количество вирусных частиц и т. п. Обычно методы прямого подсчета применяют в экстренных случаях при необходимости срочного ответа о количестве микроорганизмов (аварии в системах водоснабжения и пр.).

Другим широко используемым способом оценки микробной обсемененности является количественный высев на питательные среды. В этом случае под общим микробным числом понимают количество колоний, вырастающих на МПА в чашках Петри после определенного срока инкубации при той или иной температуре из 1 мл (для твердых субстратов — 1 г) исследуемого материала. Таким образом, чаще всего учитываются мезофильные аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы (МАФАМ), способные расти на МПА. Естественно, что получаемые при использовании этого метода цифры, как правило, значительно уступают величинам, устанавливаемым при прямом подсчете. В этом случае не учитываются мертвые, а также потерявшие способность к размножению микроорганизмы. Кроме того, не всегда оказывается возможным проведение полной десорбции микроорганизмов с частиц субстрата.

Если проба недостаточно гомогенизирована, то ряд колоний может образовываться не из отдельных клеток, а из их скоплений. Наконец, не существует универсальных питательной среды и режима инкубации, которые были бы пригодны абсолютно для всех микроорганизмов. Оценивается общая обсемененность только количественным методом без качественного состава микроорганизмов. Малая обсемененность не гарантирует безопасность в отношении золотистого стафилококка. Однако, несмотря на приведенные выше ограничения, не вызывает сомнения целесообразность и необходимость использования метода для сравнительных целей. Этот метод широко используется для санитарной оценки воды, почвы, хотя при этом значительное количество почвенных и водных микроорганизмов не учитывается (выпадают из учета анаэробы, грибы, серные, азотфиксирующие, нитрифицирующие и другие бактерии). При необходимости для учета этих микроорганизмов используют соответствующие питательные среды.

Достаточно редко применяется титрационный метод определения ОМЧ. При этом используются жидкие питательные среды. После инкубации учитывают появление роста и определяют предельное разведение, содержащее жизнеспособные микроорганизмы, а отсюда и количество последних в исследуемом материале. Этому методу свойственны те же недостатки, что и описанному выше обычному количественному высеву. Метод имеет некоторые преимущества лишь при исследовании объектов, микрофлора которых достаточно однородна; тогда используют среды наиболее пригодные для развития преобладающих видов микроорганизмов.

В последнее время активно разрабатываются автоматизированные системы, позволяющие давать быструю количественную оценку степени микробного загрязнения объектов окружающей среды. Достаточно широко используются измерительные системы для полностью автоматического обнаружения микробной контаминации (например, BACTERIA TRACER). Действие таких систем основано на принципе регистрации относительного изменения электрического сопротивления питательной среды, происходящего под действием процессов роста и жизнедеятельности микроорганизмов. Рост микроорганизмов приводит к изменению концентрации ионов в питательной среде и на измерительных электродах и тем самым к изменению электрического сопротивления в заданном интервале времени. Благодаря непрерывной регистрации и полной автоматизации степень микробного загрязнения можно определить уже через несколько часов.

Необходимо отметить, что для характеристики объектов, имеющих специфическую микрофлору, размножение которой связано с технологией производства, определение ОМЧ не применяют.

- Читать далее "Определение санитарно-показательных микроорганизмов (СПМ)"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 19.09.2019