Одной из самых современных модификаций ПЦР является ПЦР в реальном времени. Название данной модификации отражает общий ее смысл. Результат ПЦР в реальном времени можно регистрировать в процессе реакции в каждый временной промежуток. Для создания такой модификации использовали два хорошо известных факта:

1) термостабильные ДНК-полимеразы имеют дополнительную экзонуклеазную активность. Иными словами Taq ДНК-полимераза способна не только синтезировать нить ДНК на матрице другой нити, но и расщеплять двуцепочечные участки, которые встретятся на ее пути;

2) физикам давно известны химические соединения, которые флуоресцируют при облучении и которые тушат флуоресценцию.

Тест-система ПЦР в реальном времени содержит не только пару праймеров, но и дополнительный зонд (короткую одноцепочечную ДНК размером 17-10 нуклеотидов, синтезированную химическим путем), комплиментарный внутреннему участку фрагмента. К зонду ковалентно «пришиты» два химических соединения или две молекулы. Одна из них способна флуоресцировать при облучении и является флуоресцентной меткой (reporter).

Другая молекула является гасителем флуоресценции (quencher); она гасит флуоресценцию флуоресцирующей молекулы. Taq ДНК-полимераза продвигается по одноцепочечной матрице и, достигнув зонда, расщепляет его. При этом расстояние между флуоресцентной меткой и гасителем флуоресценции увеличивается, и флуоресценция больше не гасится. Регистрируя интенсивность свечения, исследователь может узнать о ходе реакции без дополнительной стадии—электрофореза. Схема ПЦР в реальном времени представлена на рисунке ниже.

ПЦР в реальном времени проводят в особом приборе, который представляет собой амплификатор, совмещенный с флюориметром. В процессе ПЦР происходит считывание результатов амплификации. Применение ПЦР в реальном времени дает возможность проводить количественные исследования микроорганизмов. Кроме того, используя различные красители, можно определять несколько инфекционных агентов в одной пробе.

Преимущества ПЦР в реальном времени:

1. Информацию о составе пробы и о ходе реакции можно получить, не открывая пробирку. Это ускоряет получение результата и снижает опасность контаминации.

2. Наличие специфического зонда, комплементарного внутреннему участку фрагмента, позволяет дополнительно проверить специфичность полученного фрагмента и снижает риск получения ложноположительных результатов.

3. Регистрация интенсивности флюоресценции дает возможность судить о количестве в пробе исходного инфекционного агента.

4. Имеется возможность проводить так называемую множественную ПЦР, т. е. регистрировать в одной реакции несколько инфекционных агентов, используя различные флуоресцентные красители.

Единственным препятствием для широкого использования ПЦР в реальном времени является довольно высокая стоимость прибора. Пока немногие лаборатории, которые широко используют ПЦР, оснащены приборами для проведения ПЦР в реальном времени. Однако есть надежда, что такая модификация ПЦР получит развитие в будущем.

- Читать далее "ИФА в диагностике инфекционных заболеваний"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 31.08.2019