Условия хроматографирования проб с авермектином и обработка результатов: жидкостной хроматограф Ди Pont 8800 (США) с флуоресцентным детектором Kratos-Sthaeffel FS 950 (Англия); металлическая колонка Диасорб-130-С 16Е 250x4 мм, 6 мм («БиоХимМак», Россия); подвижная фаза метанол:вода (98 : 2); скорость подвижной фазы 2 мл/мин.; длина волн возбуждения 365, эмиссии 470 нм; время удерживания H2Bi6 16,6, H2Bia 18,6 мин.

Содержание авермектина в анализируемых пробах рассчитывали по формуле, где Х- содержание авермектина в анализируемой пробе, нг/г; S1 - площадь пиков фракции H2Bia в стандарте, мм2; S2 - площадь пиков фракции H2Bi6 в пробе, мм2; С -количество стандарта в пробе, вносимой в хроматограф, нг; V1 -объем пробы, вносимой в хроматограф (50 мкл); V2 - общий объем пробы (0,7 мл); Р - масса анализируемой пробы, г.

Для изучения фармакокинетики ивермектина разработаны разные методы его выявления в органах и тканях, сыворотке крови и молоке. Однако многие методы из-за своей сложности и недостаточной чувствительности малоэффективны.

Пробы крови в объеме 9 мл отбирали в центрифужные пробирки, содержащие 1 мл 3 % Ка2ЭДТА, 0,9 % NaCl и 500 нг абамектина. Полученные образцы центрифугировали 15 мин при 2000 об/мин. Затем 1 мл плазмы помещали в центрифужную пробирку, добавляли 2 мл метанола, тщательно перемешивали на Vortex и центрифугировали 30 мин при 6000 об/мин. Супернатант фильтровали через мембранный фильтр (размер пор 0,45 мкм) типа «Свиннекс» и наносили на патрон для твердофазной экстракции Chromabond C8 100 mg, предварительно промытый 1 мл метанола. Промывка патрона и нанесение образцов осуществляли самотеком. Раствор после патрона отбрасывали. Патрон сушили азотом 2 мин при 5 атм. и промывали 1 мл метилтретбутилового эфира. Элюат собирали в пробирку с притертой пробкой.

В элюат добавляли 50 мкл 1-метилимидазола, перемешивали, вносили 50 мкл трифторуксусного ангидрида, перемешивали еще раз и отстаивали до образования маслообразного осадка и просветления надосадочного слоя. Из надосадочного слоя осторожно отбирали 100 мкл раствора и переносили в пробирку с притертой пробкой, содержащую 1 см3 ацетонитрила. После проведения всех вышеперечисленных процедур образец готов для ВЭЖХ анализа.

В качестве стандартных растворов используют шесть образцов крови с известными концентрациями ивермектина и абамектина. Для этого в центрифужных пробирках готовят шесть водных растворов объемом 1 мл, содержащих 3 % Nа2ЭДТА, 0,9 % NaCl, ивермектин (0, 10, 50, 100, 500, 1000 нг, соответственно) и абамектин 500 нг. рН растворов доводят до 7,4 раствором NaOH. Ивермектин и абамектин добавляют в виде аликвот ацето-нитрильных растворов. Конечное содержание ацетонитрила не должно превышать 0,1 % для предотвращения гемолиза крови.

В пробирки с приготовленными растворами отбирали по 9 мл крови, получая шесть стандартных образцов крови с концентрациями ивермектина 0, 1,5, 10, 50, 100 и абамектина 50 нг/мл. Дальнейшую подготовку проб проводили аналогично образцам крови.

Хроматографический анализ проводили на ВЭЖХ системе «Стайер», состоящей из ВЭЖХ насоса серии 2, флуориметрического детектора модели 121, колонки Luna С 18(2) 5 um 150x2,0 mm. Подвижная фаза - ацетонитрил: метанол -5:4, скорость потока 300 мкл/мин. Объем инжектируемой пробы 20 мкл. Детектирование вели по интенсивности флуоресценции производных ивермектина и абамектина (компоненты В1a) при длинах волн возбуждения и эмиссии 365 и 470 нм соответственно.

Для получения достоверных результатов проверяют линейность калибровочной кривой, построенной по отношению площадей хроматографических пиков ивермектина и абамектина (компоненты B1a) от концентрации ивермектина.

- Читать далее "Определение пиперазинов в тканях. Техника оценки концентрации пиперазина"