Значение белка Nef в репликации ВИЧ
Плейотропные эффекты вирусного белка Nef (мол. масса 27 кДа) были выявлены в различных лабораторных исследованиях, которые показали влияние этого белка и на процесс инфицирования клетки, и на репликацию вируса, а также на иммунный ответ.
Последовательности нуклеотидов области гена nef весьма гетерогенны, и разные аллели nef в различных типах клеток (например, в Т-клеточных линиях или в свежевыделенных CD4+-лимфоцитах) могут существенно различаться по активности. Было сделано предположение об участии белка Nef в проникновении вируса в клетку. Некоторые исследования с псевдовирионами показали, что Nef может способствовать слиянию оболочки вируса с мембраной инфицируемой клетки с помощью механизма, не зависящего от рН, но большинство полученных данных указывает только на внутриклеточные функции Nef, связанные с его участием в репликации ВИЧ.
Как и циклофилин, Nef обнаруживается внутри вириона и, по-видимому, принимает участие в декапсидации нуклеоида вируса сразу после проникновения его в клетку; кроме того, он усиливает обратную транскрипцию. Недавно проведенные исследования показали, что включение Nef в дочерние вирионы не является необходимым для реализации таких эффектов Nef, как усиление инфекционной способности и репликации ВИЧ.
Внутриклеточные эффекты Nef проявляются в снижении экспрессии молекул МНС I класса и CD4, а также бета-цепи молекулы CD8aP. Nef усиливает эндоцитоз названных мембранных молекул за счет связывания с их внутриклеточными цитоплазматическими доменами с одной стороны и ассоциацией с липидными рафтами мембраны с другой стороны.
Уменьшение экспрессии молекул МНС I класса на мембране сопровождается накоплением этих молекул во внутриклеточных органеллах. Nef также может нарушать экспрессию молекул МНС класса II и усиливать эндоцитоз молекул CD28, вызывая снижение экспрессии CD28 на клеточной мембране. Эффекты Nef в отношении мембранных молекул МНС, CD4, CD3 и CD28 обусловлены различными доменами данного вирусного белка.
Уменьшение экспрессии молекул CD4 происходит быстро, и на ранних стадиях инфекции это зависит от действия Nef, тогда как позже зависит от других вирусных белков - Vpu и белков вирусной оболочки, что в конечном счете обеспечивает оптимальное (для вируса) снижение экспрессии CD4. Влияние Nef на CD4 может усиливать ВИЧ-инфицирование, поскольку стабилизирует связь gpl20 с gp41.
Было показано, что Nef участвует в транспорте вновь синтезированного холестерола в места, где происходит отпочкование вируса, что необходимо для формирования инфекционных вирионов. Было обнаружено, что Nef связывается с «поздним доменом» - р6 в большом белке-прекурсоре Gag/Pol, и это важно для накопления Nef в вирионе и помогает процессу отпочкования. Также было показано, что Nef способствует встраиванию в вирионы гликопротеинов оболочки ретровируса за счет увеличения их накопления в поздних эндосомах.
Недавно появилось сообщение о возможном участии секретируемого Nef в предотвращении переключения В-клеток на синтез антител другого класса (например, иммуноглобулинов М [IgM] или IgG).
Также обнаружение Nef внутри вирионов, его связь с активностью протеинкиназы и потенциальная роль в процессе активации CD4+-лимфоцитов (см. ниже) говорят о том, что он участвует в установлении пермиссивного состояния репликации вируса на ранних стадиях инфекции. По-видимому, Nef связан с белком с мол. весом 65 кДа, который по серологическим и функциональным свойствам относится к классу р21-активируемых киназ, участвующих в механизмах проведения сигналов.
Первоначально предполагали, что ген nef может играть роль в развитии латентного состояния вируса в клетке, поскольку делеция этого гена из молекулярного клона штамма ВИЧ-1SF2 приводила к появлению разновидности вируса, который реплицировался до более высоких титров и обладал более выраженными цитопатогенными свойствами по сравнению с исходным изолятом SF2. В дальнейших исследованиях было показано, что ген nef от изолята ВИЧ-1SF2 (связанный с вирусной LTR или промотером обезьяньего вируса SV40), трансфецированный в клетки перевивной линии Т-лимфоцитов, подавляет репликацию вируса.
Однако белок Nef, полученный от вируса биотипа Х4 с выраженными цитопатогенными свойствами, не обладал таким действием. Кроме того, была показана корреляция между прекращением репликации вируса и высоким уровнем экспрессии Nef у ВИЧ-инфицированных линий астроцитов человека. Аналогично в биопсийном материале мозга детей и взрослых была показана активная экспрессия Nef в клетках, не продуцирующих вируса.
Продемонстрировано угнетение активности LTR ВИЧ под действием определенного участка гена nef. Таким образом, Nef может подавлять вирусное инфицирование астроцитов, однако механизмы этого явления неизвестны. Работы, проведенные на линиях Т-клеток с другими изолятами ВИЧ и SIV, говорят в поддержку того, что ген nef может угнетать репликацию вируса в Т-клетках и моноцитах, особенно через LTR (сайты для факторов транскрипции NF-kB и АР-1).
Несмотря на результаты таких ранних исследований, предположение об угнетении продукции вируса под действием Nef не было подтверждено в других работах. Некоторые исследования показали, что делеции гена nef приводят к снижению репликативной способности вирусов и, по-видимому, к их аттенуации. Важно отметить, что изучение активности белка Nef на нормальных свежевыделенных CD4+-лимфоцитах привело к получению иных результатов, чем при использовании клеток трансформированных линий Т-лимфоцитов.
Некоторые варианты вирусов с мутациями в гене nef лучше реплицировались в макрофагах, чем в клетках перевивных линий Т-лимфоцитов, тогда как другие аллели гена nef у других вирусов коррелировали с усиленной репликацией как в свежевыделенных CD4+-лимфоцитах, так и в клетках перевивных линий Т-лимфоцитов. Такая гетерогенность аллелей вирусного гена nef может объяснять, почему в ранних работах не обнаружили негативного влияния Nef на экспрессию ВИЧ.
Необходимо отметить, что результаты экспериментов на животных не показали подавления вируса под действием Nef. У макак резус мутан-тный вирус с делецией гена nef проявлял менее выраженные патогенные свойства, чем его разновидность дикого типа. Предположение о влиянии Nef на патогенность вируса также появилось после проведения исследования на мышах SCID, в которых мутантные штаммы ВИЧ-1 с делецией гена nef медленнее размножались и не вызывали снижения количества CD4+-клеток в организме животных. Эта функция Nef была наиболее ярко выражена в инфицированных нестимулированных CD4+-лимфоцитах.
В этих клетках большинство вирусов с делецией nef размножались слабо, хотя в активированных CD4+-лимфоцитах они росли хорошо. Кроме того, делеция гена nef была обнаружена у некоторых изолятов ВИЧ-1, выделенных от пациентов с длительным бессимптомным течением заболевания, и у вирусов, выделенных от реципиентов, которым была перелита зараженная кровь, но на момент исследования не было клинических симптомов заболевания.
Эти исследования показали, что в некоторых случаях Nef может вызывать замедление прогрессирования заболевания. Однако со временем у части таких пациентов все же развивался СПИД.
Влияние Nef на продукцию высоких концентраций вируса может быть вторичным по отношению к его воздействию на ранние этапы проникновения вируса в клетку и/или обратную транскрипцию. Nef модулирует активность белков, таких как киназы ВАК и РАК, участвующие в кальций-зависимых путях передачи сигналов в клетке и может вызывать активацию клетки через NFAT-1. Nef также ослабляет внутриклеточную передачу сигнала от TCR, взаимодействуя с комплексом CD3 : а-/b-цепи TCR.
Такое потенциальное воздействие Nef на активацию Т-клеток и его связь с активностью сериновой киназы говорят о том, что его влияние на репликацию ВИЧ связано с механизмами передачи сигнала внутри клетки. Таким образом, влияние Nef на внутриклеточную среду может определять результат его действия на репликацию конкретного изолята ВИЧ в клетке. Предположительно, уменьшение экспрессии CD4 под действием Nef, описанное выше, способствует репликации вируса за счет предотвращения гибели клетки при ее слиянии с другими клетками и других CD4-зависимых процессов.
Тем не менее исследования показали, что угнетение экспрессии CD4 под действием Nef, возможно, не связано с его влиянием на репликацию вируса.
Что касается действия Nef на иммунный ответ, показано, что этот вирусный белок подавляет продукцию таких цитокинов, как IL-2 и IFN-y, но индуцирует продукцию IL-10, что может приводить к угнетению иммунных реакций 1 типа. Таким образом, в зависимости от того, какие из эффектов Nef в отношении продукции цитокинов будут преобладать в конкретных ситуациях, проявят те или иные особенности развития иммунного ответа и интенсивность репликации ВИЧ.
При развитии инфекции в клетке Nef может индуцировать продукцию хемокинов МIР-1а и MIP-1b, что способно повлиять на процессы хемотаксиса клеток. Эти эффекты Nef, по-видимому ассоциированы с инфицированными макрофагами и вирусами биотипа R5.
Инфицированные макрофаги посредством белка Nef могут действовать на покоящиеся CD4+-клетки. Nef вызывает индукцию белков (растворимого CD23 и растворимого ICAM), которые в свою очередь усиливают экспрессию рецепторов для антигенов (BCR) на В-клетках, что каким-то образом способствует возрастанию восприимчивости CD4+-лимфоцитов (даже покоящихся) к ВИЧ-инфекции. Этот механизм может принимать участие в ВИЧ-инфицировании покоящихся CD4+-клеток.
Исследования эффектов Nef в культуре клеток показали, что он способен вызывать гибель CD4+-клеток по механизму апоптоза. В некоторых исследованиях показано участие в этих процессах b-цепи TCR и увеличение экспрессии Fas лиганда. Однако в других исследованиях было показано, что Nef может тормозить апоптоз за счет взаимодействия с ки-назой ASK-1 (apoptosis signal-regulating kinase-1), которая представляет собой треониновую киназу, участвующую в механизме передачи сигнала при взаимодействии Fas с Fas-лигандом. Кроме того, Nef может связываться с супрессором опухолей, белком р53 и тем самым тормозить апоптоз. Такая активность вирусного белка может удлинять время жизни инфицированной клетки, следовательно, и время репликации ВИЧ в этих клетках.
Подводя итог, можно сказать, что различные эффекты белков Nef скорее всего связаны с его взаимодействием с различными внутриклеточными белками (число которых превышает 30), возможно, приводящим к их фос-форилированию, механизмы которого требуют дальнейшего изучения. Его влияние на репликацию ВИЧ в целом зависит от конкретной аллели Nef, от типа инфицированной клетки и особенно от конкретной локализации белка Nef в клетке.
Также, судя по всему, с разными участками молекулы белка Nef ассоциированы разные проявления биологических активностей. Большинство исследователей в настоящее время считают, что основная функция этого вирусного белка, содержащегося в составе вирионов, скорее связана с активацией и поддержкой репликации вируса, чем с угнетением его репликации. Тем не менее исключения, описанные выше, могут указывать на то, что в некоторых клетках определенные аллели Nef могут вносить свой вклад в установление латентного состояния вируса.
c Не обнаружен внутри вириона
d Обнаружен только в ВИЧ-1
e Закодирован только в ВИЧ-2. Возможно, является двойником Vpr
*Есть и другое мнение: NC (р7 или р9) выполняет роль шаперона для геномной РНК ВИЧ и защищает её от разрушения РНКазой Н.
**Rev выводит вирусную РНК несплайсированной из ядра, что дает возможность части РНК стать геномной для дочерних вирионов.
***Nef защищает зараженные клетки от преждевременного апоптоза; ингибирует на клетках экспрессию MHC-I, чем защищает инфицированные клетки от атаки цитотоксических Т-лимфоцитов.
****Vpr входит в состав преинтеграционного комплекса и обеспечивает продвижение этого комплекса в ядро
- Читать "Значение белков Vpr и Vpx в репликации ВИЧ"
Оглавление темы "Регуляция ВИЧ":- Значение белка Rev в репликации ВИЧ
- Значение белка Tat в репликации ВИЧ
- Значение белка Nef в репликации ВИЧ
- Значение белков Vpr и Vpx в репликации ВИЧ
- Значение белка Vpu в репликации ВИЧ
- Геном ВИЧ ответственный за цитопатогенные свойства
- Геном ВИЧ ответственный за снижение экспрессии CD4
- Успехи изучения генома ВИЧ
- Резюме по белкам ВИЧ ответственным за его свойства
- Влияние ВИЧ на костный мозг