Определение содержания бактериальных метаболитов в биологических субстратах

Для определения содержания и спектров бактериальных метаболитов в различных биологических субстратах широкое распространение получили методы жидкостной и газожидкостной хроматографии. С их помощью можно определять содержание и профили целого ряда НММ в соответствующем биотопе для характеристики интегральной биохимической активности регионарной микрофлоры: летучих жирных кислот, дикарбоновых кислот (молочной, щавелевоуксусной и α-кетоглутаровой), углеводов, фенольных соединений, ароматических аминокислот; аминов простых (метиламин и др.) и сложных (гистамин, серотонин и др.). Независимо от того, пребывает эндоэкологическая система в норме или патологии, в ней всегда присутствуют одни и те же метаболиты.

Различия касаются локализации и содержания отдельных компонентов. Изменения спектров НММ аутохтонной микрофлоры в различных биотопах организма человека (кишечнике, ротоглотке, влагалище, крови и т. д.) являются достаточно чувствительным и надежным индикатором патологических изменений в регионарном микробном ценозе, поскольку они происходят раньше, чем видовые изменения. В работах последних лет показано, в частности, что уровни и спектры ЛЖК, выявляемые в фекалиях, слюне, вагинальном отделяемом, отражают структурный и метаболический дисбаланс микробиоценозов, коррелируют с клиническими проявлениями, характерны для различных патофизиологических состояний кишечника, респираторного тракта, половых путей (в том числе синдрома раздраженной толстой кишки, колитов, острых и хронических заболеваний легких, печени, вагинитов и т.д.).

Метод газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ), используемый для изучения функциональной активности микрофлоры кишечника, позволяет определить содержание и спектр ЛЖК в копропробах. Отмечено, что при различных патофизиологических состояниях желудочно-кишечного тракта и его заболеваниях процесс образования, всасывания и утилизации ЛЖК нарушается, поэтому общая концентрация и, особенно, соотношение отдельных ЛЖК (спектры) в фекалиях меняются. Таким образом, разнонаправленные отклонения от физиологической нормы количества и спектра этих метаболитов могут служить биохимическими маркерами структурных и функциональных нарушений кишечного микробиоценоза. Информация об интегральном количестве ЛЖК в кишечнике и крови имеет диагностическое и прогностическое значение.

Определение метаболической активности микрофлоры кишечника, в частности, уровней ЛЖК, существенно дополняет данные микробиологического анализа «на дисбактериоз», которые в ряде случаев способствуют выяснению этиопатогенеза заболеваний, но не отражают полностью структуру микробиоценоза и метаболическую активность анаэробной микрофлоры, особенно ее пристеночных популяций. Анализ абсолютных и относительных показателей содержания ЛЖК в фекалиях совместно с данными копрологического анализа с известным набором признаков (физические параметры, степень гидролиза поступающих в толстую кишку нутриентов, эффективность желчеотделения, всасывательная способность слизистых, скорость транзита и др.) дает представление о процессе микробного пищеварения в толстом кишечнике.

Комплексный анализ микрофлоры кишечника (биохимический, копрологический и микробиологический) позволяет всесторонне охарактеризовать биоценоз кишечника, в том числе такие его характеристики, как трофическая база, инфраструктура, качественный и количественный состав, метаболическая активность микрофлоры, энергообеспеченность, процесс микробного пищеварения. Такой анализ позволяет оценивать структурные и функциональные нарушения экосистемы «толстый кишечник — населяющая его микрофлора», способствует выяснению возможных причин и механизмов их формирования, выбору адекватной комплексной терапии, своевременной оценке ее эффективности.

Научно-исследовательской фирмой «Ультрасан», Учебным центром Медицинского центра управления делами Президента РФ, Московским НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского был разработан экспресс-метод определения метаболической активности микрофлоры кишечника для характеристики микроэкологических и функциональных нарушений толстой кишки по содержанию ЛЖК и их изоформ в фекалиях. Метод отличается от известных хроматографических методик использованием капиллярной колонки и упрощенной пробоподготов-кой (подкислением и центрифугированием образца). Метод дает возможность вести исследования в истинно анаэробных условиях без потери информации вследствие окисления субстратов и гибели анаэробов.

Рассчитанные показатели сравнивают с показателями, характерными для физиологической нормы. В качестве физиологической нормы используют средние (медиана) показатели, полученные при анализе проб от людей различного возраста, у которых не было выявлено клинических проявлений заболеваний ЖКТ, отклонений в данных копрологического и микробиологического анализов. Как следует из таблицы, в группе нормы относительные концентрации ЛЖК (спектры) претерпевают меньший разброс, чем абсолютные концентрации, и, следовательно, являются существенными при оценке структурного и метаболического дисбаланса микробиоценоза кишечника.

Определение содержания бактериальных метаболитов в биологических субстратах

Из полученных концентраций ЛЖК обычно рассчитывают следующие параметры:

• общий уровень микробных метаболитов (сумма концентраций ЛЖК ряда С2-С6 с изоформами ЛЖК — iC4, iC5, iC6 мг в 1,0 г образца);

• долю метаболитов анаэробной микрофлоры в общем пуле ЛЖК (анаэробный индекс — АИ): отношение суммы концентраций ЛЖК ряда С3-С6 с изоформами к концентрации С2;

• преобладающий тип брожения, устанавливаемый из нижеследующих показателей: абсолютные показатели нормальных и изоформ ЛЖК — содержание (мг каждой кислоты в грамме образца); относительные показатели ЛЖК (спектры) — доля каждой кислоты в общем пуле кислот; отношение содержания изоформы ЛЖК к содержанию ее нормальной формы;

• показатель интегральной протеолитической активности микрофлоры, о котором судят по соотношению суммы концентраций изоформ ЛЖК к сумме концентраций соответствующих нормальных ЛЖК.

Выявлены типичные отклонения от физиологической нормы показателей ГЖХ-анализа при различных патофизиологических состояниях у взрослых:

• при системном ингибировании активности микрофлоры кишечника (применение антибиотиков широкого спектра, голодание, стресс, возрастные изменения);

• при селективной полисахаридной гиперстимуляции активности микрофлоры (тонкокишечная неусвояемость углеводов);

• при селективной пептидной гиперстимуляции активности микрофлоры (тонкокишечная неусвояемость пептидов);

• при системной липидной гиперстимуляции активности микрофлоры (нарушение липидного обмена, энтерогепатической циркуляции желчных кислот);

• при эффекте overgrowth (колонизация тонкого кишечника толстокишечной микрофлорой);

• при состоянии белково-энергетического дефицита; таких синдромах, как диарея, запор и др.

Использование метода ГЖХ-анализа в сочетании с коггрологическим анализом дает возможность врачу получить первичную информацию:

• об энергообеспечении системы (хозяин/микрофлора); возможном белково-энергетическом дефиците организма;

• о структуре и метаболической активности анаэробных и факультативно-анаэробных популяций микробиоценоза (их угнетении или гиперколонизации);

• о вероятности попадания толстокишечной микрофлоры в тонкий кишечник (синдром гиперколонизации);

• о наличии нарушений ферментативного пищеварения в тонком кишечнике и микробного пищеварения в толстом кишечнике;

• о процессах всасывания и транзита ЛЖК и субстратов;

• о состоянии слизистой и ее колонизационной резистентности;

• о возможности воспалительного процесса, прогноза его возникновения или обострения;

• об общем количестве ЛЖК — бактериальных метаболитов с потенциально патогенетическими свойствами, возможности проникновения во внутреннюю среду организма токсических бактериальных метаболитов.

Изоформы ЛЖК — продукты микробной ферментации белков и аминокислот характеризуют протеолитическую активность микрофлоры. Соотношение суммы концентраций изоформ ЛЖК и суммы концентраций соответствующих нормальных ЛЖК несет информацию о соотношении сахаролитического и протеолитического типов брожения. Появление повышенных концентраций изоформ ЛЖК часто коррелирует с недостаточным поступлением в системный кровоток незаменимых аминокислот, а также с ростом концентрации в системном кровотоке токсических метаболитов. Выраженные отклонения от нормы уровней изокислот указывают на возможный аминокислотный дисбаланс.

Следует отметить значимость такого интегрального параметра, как «коэффициент фильтрации ЛЖК» — отношение концентраций ЛЖК в крови к таковым в супернатанте фекалий, показывающим одновременно целостность эпителиальных тканей, детоксикационную активность гепато-билиарной системы и степень токсической нагрузки на гемато-энцефалический барьер. Особенно информативны коэффициенты фильтрации, относящиеся к наиболее токсичным разветвленным ЛЖК — изомасляной, изовалериановой и изокапроновой кислотам. Именно эти кислоты в наибольшей степени токсичны для гепатоцитов и в наибольшей степени деполяризуют мембраны клеток нейроглии.

Перспективы применения ГЖХ-метода анализа НММ связаны со следующими направлениями работ:

• дальнейшее расширение базы данных и уровня компьютеризации их обработки;

• расширение использования метода анализа различных субстратов (кал, кровь, слюна и пр.) с одновременным сопоставлением результатов;

• расширение спектра изучаемых патологий;

• расширение спектра анализируемых метаболитов (не только ЛЖК, но, в первую очередь, аминов, меркаптанов и др.).

Последнее направление представляется не только вполне доступным для реализации, но и весьма перспективным, т. к. оно дает возможность отслеживать опасные осложнения, связанные с системной интоксикацией, бактериемией, сепсисом и т. д.

Концепция разработки новых препаратов-пребиотиков — компонентов продуктов функционального питания будет рассмотрена в отдельной статье на сайте.

- Вернуться в оглавление раздела "Медицинская микробиология"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 22.6.2020

Остались вопросы или замечания?

Все размещенные статьи преследуют образовательную цель и предназначены для лиц имеющих базовые знания в области медицины.
Без консультации лечащего врача нельзя применять на практике любой изложенный в статье факт.
Жалобы и возникшие вопросы просим присылать на адрес statii@dommedika.com
На этот же адрес ждем запросы на координаты авторов статей - быстро их предоставим.