Известно, что патогенные и непатогенные Е. coli не различаются по ферментативным свойствам и на средах первичного посева образуют практически одинаковые колонии, поэтому поиск и выделение энтеропатогенных эшерихий проводят следующим образом. Материалом для исследования являются фекалии, рвотные массы, моча, пищевые продукты. Фекалии собирают сразу после дефекации с пеленки, из горшка, судна, лотка, предварительно продезинфицированных и хорошо отмытых водой для удаления дезинфектанта, и помещают в стерильную посуду и контейнер с широким горлом и плотно закрывающейся крышкой.

Рвотные массы, мочу и другой материал также собирают в стерильную посуду с соблюдением мер, предотвращающих контаминацию извне. Собранный материал не позднее чем через 2 ч должен быть доставлен в лабораторию для исследования. При невозможности соблюдения таких сроков следует использовать консерванты. Наиболее часто в качестве транспортного раствора пользуются глицериновой смесью (химически чистый глицерин и 0,9%-ный раствор натрия хлорида). Можно также использовать фосфатно-буферную смесь (KH₂PO₄ + Na₂HPO₄ безводный + вода дистиллированная) и др. Доставленный материал необходимо по возможности сразу же засеять на соответствующие питательные среды. До момента посева хранить при 4°С.

Первый день. Исследуемый материал засевают на чашки со средой Эндо и Плоскирева. Посев производят по 0,1 мл из 10-кратных разведений в 0,1%-ной пептонной воде (10^-3 и 10^-5). Мочу высевают но общепринятой методике (Приказ М3 СССР № 535). Посевы помещают в термостат при 37°С на 18-24 ч.

Второй день. Просматривают чашки, засеянные накануне. Отбирают колонии для дальнейшего изучения. На среде Эндо лактозоположительные Е. coli образуют темно-красные с металлическим блеском или без него, розовые с красным центром колонии; лактозоотрицательные штаммы — светло-розовые колонии, иногда с бесцветным ободком, некоторые полупрозрачные, напоминающие колонии шигелл и сальмонелл. При наличии однотипных колоний для исследования отбирают не менее 10 колоний, в случае роста разнородных колоний берут 2-3 колонии каждого вида. Отбор колоний, выросших на чашках первичного посева, проводят серологическим методом в реакции агглютинации на стекле с поливалентной сывороткой ОК (смесь антител к О- и К-антигенам), используя примерно половину S-колонии.

Оставшуюся часть колонии, давшей положительную реакцию с сывороткой, пересевают петлей на скошенный агар и агар Клиглера или другую комбинированную среду для первичной идентификации.

Третий день. Учитывают результаты роста на комбинированной среде: отмечают ферментацию глюкозы (изменение цвета среды в столбике) и наличие газообразования, ферментацию лактозы (реакция учитывается на скошенной части среды), продукцию сероводорода (при положительной реакции появляется черное окрашивание разной интенсивности). Культуры, ферментирующие глюкозу до кислоты и газа, ферментирующие или не ферментирующие лактозу, не продуцирующие сероводорода, подозрительны на принадлежность к роду Escherichia. Такие культуры повторно проверяют в реакции агглютинации на стекле с поливалентной сывороткой ОК, содержащей антитела к О- и К-антигенам. В случае получения положительной реакции культуру со скошенного агара петлей пересевают в полужидкий агар (под пробку этой пробирки помещают индикаторную бумажку на индол), среду Симмонса, среду с мочевиной, среду с лизином, среды Гисса с адонитом, инозитом, сорбитом, рамнозой, среду Кларка для подтверждения принадлежности выделенных культур к Е. coli.

Для определения подвижности целесообразно сделать посев не просто уколом в столбик полужидкого агара, а в пробирки по Крейджи (до стерилизации в пробирку с полужидким агаром помещают стеклянную трубочку длиной 3-4 см диаметром 0,5 см). Посев делают в верхний конец трубочки, выступающий над поверхностью агара в пробирке. Такой прием позволяет получить культуру для определения H-антигена.

Четвертый день. Учитывают результаты посевов, сделанных накануне. При выделении Е. coli проводят серологическую идентификацию с целью определения серотипа. Для исследования О- и К-антигенов используют суточную культуру на скошенном агаре. Культуры, давшие положительный результат с одной из поливалентных OK-сывороток или ОК-иммуноглобулинами, исследуют в реакции агглютинации на стекле с отдельными групповыми OK-сыворотками, входящими в поливалентную сыворотку, или ОК-иммуноглобулинами. Ориентировочный результат с отдельной OK-сывороткой подтверждают в реакции агглютинации на стекле с OK-иммуноглобулином (живые культуры) и адсорбированными групповым и факторными О-сыворотками (с культурой, прогретой при 100°С в течение 30 мин). При отсутствии ОК-иммуноглобулинов и адсорбированных О-сывороток определение OK-группы проводят при помощи OK-сывороток в линейной реакции агглютинации с живой (определение К-антигена) и прогретой при 100°С в течение 1 ч (определение О-антигена) культурой.

После установления OK-группы у подвижных штаммов определяют Н-антиген методом иммобилизации при помощи антисыворотки в полужидком агаре. Предложена методика определения Н-антигена в реакции агглютинации на стекле с использованием культур, выращенных на глицериновом агаре, усиливающем подвижность, и поливалентных Н-сывороток.

Пятый день. Учитывают результаты линейной реакции агглютинации и результаты определения Н-антигена методом иммобилизации в полужидком агаре.

Крупнохлопчатый агглютинат с живой культурой до 1/2 или титра К-антигел и мелкозернистый агглютинат с прогретой культурой до 1/2 или титра О-антител свидетельствуют о принадлежности выделенного штамма к соответствующей OK-группе. Н-антиген обозначают по наименованию той Н-сыворотки, добавление которой в полужидкий агар вызвало иммобилизацию (рост только по уколу) штамма.

По совокупности установленных О-, К- и Н-антигенов определяют серотип выделенного штамма.

К сожалению, отсутствуют отечественные простые, доступные практическим лабораториям методы определения таких факторов патогенности Е. coli, как L-T и S-Т энтеротоксины, и факторы колонизации. За рубежом для этих целей разработаны и применяются методы ИФА, ИФ и др.

Для постановки диагноза кишечного эшерихиоза у детей и взрослых необходим комплекс исследований.

Бактериологическими критериями этиологической значимости эшерихий при острых кишечных инфекциях можно считать серологическую метку на уровне серотипа, характеристику обсемененности материала, а также данные о наличии генов, ассоциированных с патогенностью, каждого патовара E.coli. Для идентификации Е. coli по ферментативным свойствам могут быть использованы автоматизированные тест-системы API-20E, Enterotube, фирмы «Лахема», отечественные тест-системы производства Ставропольского и Нижегородского предприятий, а также НПО «Питательные среды», ФГУП «Микроген».

В последнее время много внимания уделяется ЭГКП, способным вызывать кровавый понос у людей с тяжелыми патологическими состояниями — гемолитическим уремическим синдромом, тромботической тромбоцитопенической пурпурой. Эта группа эшерихий представлена большим числом серотипов, но наибольшее эпидемиологическое значение в возникновении указанной патологии имеет 0157:117. Для диагностики этого возбудителя применяют среду с сорбитом, так как Е. coli 0157:Н7 не ферментируют или замедленно ферментируют сорбит. Предложена также среда, содержащая Н-7 сыворотку.

В качестве экспресс-диагностики используют ПДР для обнаружения генов вирулентности, характерных только для ЭГКП, и ИФА для определения типа энтеротоксина.

- Читать далее "Сальмонеллы (Salmonella): таксономия"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 27.12.2019