Изготовление дисков, необходимых для постановки диско-диффузионного метода, в лабораторных условиях нецелесообразно. Это связано с жесткими требованиями к исходным материалам (субстанциям антибиотиков, картону) и со значительной трудоемкостью методов контроля качества дисков.

Постановка диско-диффузионного метода оценки антибиотикочувствитель-ности включает следующие этапы:
— приготовление питательных сред;
— приготовление суспензии микроорганизма и инокуляция;
— наложение дисков и инкубация;
— учет результатов.

Для получения правильных результатов при постановке диско-диффузионного метода необходимо жестко соблюдать правила хранения и использования коммерческих дисков, в противном случае содержание в них антибиотиков может опуститься ниже допустимого уровня (прежде всего в результате увлажнения) еще до истечения срока годности.

Диски должны храниться при температуре 4-8 °С, плотно укупоренными, чтобы исключить попадание во флакон влаги; для дополнительной гарантии во флаконах (картриджах) с коммерческими дисками имеется влагоуловитель (силикагель). Диски, содержащие бета-лактамные антибиотики, должны храниться при температуре ниже -14 °С. Небольшие партии дисков, используемые в повседневной работе, можно хранить в течение 5-7 дней при 4-8 °С.

Флаконы (картриджи) с дисками целесообразно извлекать из холодильника за 1 ч до начала работы и выдерживать закрытыми при комнатной температуре, это обеспечивает выравнивание температуры дисков и окружающей среды и, соответственно, предотвращает образование конденсата влаги после открывания флаконов.

а) Приготовление чашек с питательной средой. К качеству питательных сред для постановки диско-диффузионного метода предъявляются те же требования, что и к плотным питательным средам для постановки метода серийных разведений в агаре, соответственно используются и те же методы контроля качества.

Приготовление чашек Петри с плотной питательной средой имеет некоторые особенности. Плотную питательную среду готовят в соответствии с инструкцией изготовителя. Перед заполнением расплавленной средой чашки Петри устанавливают на строго горизонтальную поверхность (выверенную по уровню, без впадин и выпуклостей). Глубина агарового слоя в чашке должна быть 4 мм, что достигается при внесении 25-30 мл расплавленного агара в чашку диаметром 100 мм или 60-70 мл — в чашку диаметром 150 мм. Соблюдение указанных предосторожностей необходимо в связи с тем, что размер и форма зоны ингибиции роста зависят от глубины и равномерности агарового слоя.

После заполнения чашки оставляют при комнатной температуре для застывания. При использовании свежеприготовленных чашек перед инокуляцией их необходимо подсушить, что достигается инкубацией при 37 °С с приоткрытой крышкой в течение 10-20 мин.

Хранить чашки можно запаянными в полиэтиленовые пакеты при 4-8 °С в течение 7-10 сут. При использовании чашек после хранения в холодильнике их также необходимо подсушить в течение 10-20 мин при 37 °С с приоткрытой крышкой. Перед инокуляцией необходимо проконтролировать отсутствие конденсата жидкости на внутренней поверхности крышек.

б) Приготовление суспензии и инокуляция. Для приготовления инокулята используют 18-20-часовую агаровую или 5-6-часовую бульонную культуру исследуемого микроорганизма. Суспензию или бульонную культуру доводят до мутности стандарта 0,5 Мак-Фарланда (конечная концентрация 1-2х10⁸ КОЕ/мл).

Приготовленный таким образом инокулят наносят в количестве 1-2 мл на поверхность чашки Петри с питательной средой, равномерно распределяют по поверхности покачиванием и удаляют избыток жидкости пипеткой. Приоткрытые чашки подсушивают при комнатной температуре в течение 10-15 мин.

Однако более практичным способом инокуляции является использование коммерческих стерильных ватных тампонов. Тампон необходимо погрузить в суспензию микроорганизма, избыток влаги удалить, отжимая тампон о стенку пробирки. Инокуляцию на поверхность агаровой среды проводят штриховыми движениями, периодически поворачивая чашку Петри на 60°.

в) Наложение дисков и инкубация. Не позднее, чем через 15 мин после инокуляции, на поверхность питательной среды наносят диски с антибиотиками. Операцию осуществляют при помощи автоматического диспенсора или стерильным пинцетом. Расстояние от диска до края чашки и между дисками должно быть 15-20 мм. Таким образом, на одну чашку диаметром 100 мм следует помещать не более 6 дисков. Диски должны равномерно контактировать с поверхностью агара, для чего их следует аккуратно прижать пинцетом.

Чашки непосредственно после наложения дисков помещают в термостат и инкубируют 18-20 ч при 37 °С кверху дном. Увеличение интервала между нанесением дисков на поверхность среды и началом инкубации (а соответственно и пролиферации микроорганизма) приводит к «преддиффузии» антибиотика и увеличению диаметра зоны ингибиции роста.

г) Учет результатов. После окончания инкубации чашки помещают вверх дном на темную матовую поверхность так, чтобы свет настольной лампы падал на них под углом 45° (учет в отраженном свете). Диаметр зон задержки роста с учетом диаметра самого диска измеряют с точностью до 1 мм, предпочтительнее пользоваться штангенциркулем или кронциркулем. При измерении зон задержки роста следует ориентироваться на полную ингибицию видимого роста. Не следует обращать внимание на очень мелкие колонии, выявляемые в пределах зоны задержки роста только при особых условиях освещения или увеличении, и на едва заметный налет у края зоны.

Крупные колонии, выявляемые в пределах четкой зоны ингибиции роста, свидетельствуют о наличии посторонней микрофлоры или о гетерорезистентности популяции; в этом случае необходима повторная идентификация и повторение исследования на антибиотикочувствительность.

При оценке антибиотикочувствительности роящихся штаммов протея зона задержки роста может быть затянута тонкой вуалеобразной пленкой, которая не мешает установлению границы зоны.

При оценке резистентности к сульфаниламидам и их комбинации с триметопримом границу зоны ингибиции роста следует учитывать на уровне ингибиции роста на 80%. Это связано с тем, что под действием этих препаратов перед полной ингибицией роста возможно завершение 1-2 циклов пролиферации микроорганизма.

В отличие от описанного выше метода учета результатов, при оценке антибиотикочувствительности стафилококков к оксациллину необходимо учитывать и самые мелкие колонии, выявляемые в пределах четкой зоны ингибиции роста.

- Читать далее "Контроль качества оценки антибиотикочувствительности"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 11.07.2019