Метод серийных разведений в оценке чувствительности к антибиотикам

Общим и крайне важным для всех методов серийных разведений этапом является приготовление растворов антибиотиков.

Различают основные растворы антибиотиков (пригодные для хранения) и рабочие, т.е. те, которые необходимо использовать ex tempore для приготовления питательных сред.

Для приготовления основных растворов антибиотиков используют субстанции препаратов с известной активностью, лекарственные формы не пригодны. Для приготовления навесок антибиотиков пользуются аналитическими весами или другими равного класса точности.

Основные растворы антибиотиков готовят в концентрации 1000 мкг/мл и выше. Навески антибиотиков для приготовления основных растворов готовят с учетом их активности. Расчет навески антибиотика проводят по формуле:

Вес (мг) = Объем растворителя (мл) х Необходимая концентрация (мкг/мл) / Активность субстанции (содержание антибиотика в мкг/мл).

В связи с тем, что антибактериальные препараты существенно различаются по растворимости, в ряде случаев возникает необходимость использовать разные вещества для первичной солюбилизации препаратов (растворители) и для доведения их до заданной концентрации (разбавители). В тех случаях, когда растворители и разбавители являются разными веществами, для солюбилизации антибиотика необходимо использовать минимально возможное количество растворителя.

Отличные от воды растворители и разбавители для отдельных антибиотиков приведены в таблице 11.7. Основные растворы необходимо хранить при температуре не выше -20 °С (сроки хранения отдельных антибиотиков при этой температуре существенно различаются). Оптимальными условиями для хранения основных растворов антибиотиков является температура -60 °С и ниже, длительность не более 6 мес. При этом необходимо иметь в виду, что основные растворы бета-лактамных антибиотиков могут терять активность и в более ранние сроки.

После извлечения из холодильника флаконов с основными растворами необходимо довести до комнатной температуры для предотвращения конденсации влаги и только после этого открыть. Размороженные основные растворы используют для приготовления рабочих растворов, повторное замораживание не допускается.

Готовят рабочие двукратные концентрации антибиотиков. За основу берется конечная концентрация антибиотика в питательной среде, равная 1,0 мкг/мл (более высокие — 8, и т.д. либо более низкие — 0,5, 0,25, 0,125 и т.д.). При этом реальные концентрации рабочих растворов требуют учета фактора разбавления раствора антибиотика в питательной среде (обычно 1:10). Для приготовления рабочих растворов используется дистиллированная вода. Диапазон концентраций зависит от целей исследования.

Метод серийных разведений в оценке чувствительности к антибиотикам

а) Метод серийных разведений в агаре:

1. Приготовление чашек Петри с растворами антибиотиков. Сухую агаризованную питательную среду растворяют и автоклавируют в соответствии с инструкцией изготовителя. После автоклавирования колбы с питательной средой помещают на водяную баню при 48-50 °С, где выдерживают до достижения указанной температуры, после чего в них асептически вносят рабочие растворы антибиотиков (1 часть рабочего раствора антибиотика на 9 частей расплавленного агара) и при необходимости термолабильные питательные добавки. Затем среду тщательно перемешивают и разливают по чашкам Петри, толщина слоя питательной среды должна быть 3-4 мм.

Чашки оставляют при комнатной температуре для застывания. Приготовленные указанным образом чашки Петри предпочтительнее использовать немедленно. Допускается хранение в запаянных полиэтиленовых пакетах при +4 — +8°С в течение 5 сут. При этом необходимо иметь в виду, что некоторые бета-лактамные антибиотики (прежде всего ампициллин, цефаклор, имипенем), особенно при низких концентрациях, не выдерживают даже указанный срок хранения. В этой связи стабильность антибиотиков в приготовленных в лаборатории чашках Петри целесообразно устанавливать экспериментально с использованием референтных штаммов.

Параллельно с чашками Петри, содержащими растворы антибиотиков, для контроля роста готовят чашки Петри без антибиотиков.

2. Инокуляция, инкубация и учет результатов. Конечная посевная доза исследуемого микроорганизма на поверхности питательной среды должна составлять 104 КОЕ. Поскольку при помощи коммерческих инокуляторов или стандартной бактериологической петли диаметром 3 мм можно перенести 1-2 мкл жидкости, концентрация микроорганизмов в исходной суспензии должна быть 107 КОЕ/мл. Такую концентрацию можно получить при разведении суспензии 0,5 по стандарту Мак-Фарланда в 10 раз. Полученную суспензию необходимо инокулировать на поверхность агара в течение 15 мин после приготовления, при этом образуется пятно диаметром 5-8 мм.

После инокуляции чашки оставляют при комнатной температуре для подсыхания, далее переворачивают и инкубируют при 37 °С в течение 16-20 ч.

Для контроля качества приготовления суспензий периодически рекомендуется проводить подсчет реальных колониеобразующих единиц путем высева на неселективные питательные среды. Важнейшим требованием контроля качества проведения метода оценки антибиотикочувствительности является высев использованной для инокуляции суспензии на плотную неселективную среду (например, МПА) для контроля чистоты культуры.

Результат оценки антибиотикочувствительности имеет смысл учитывать только при подтверждении чистоты культуры. Для учета результатов чашку помещают на темную не отражающую поверхность. За МПК принимают концентрацию, вызвавшую полную ингибицию видимого роста. Для дифференцировки нежного роста и налета, оставшегося после инокулята, в ряде случаев целесообразно использовать увеличение. Появление единственной колонии на чашке с концентрацией на одно разведение выше, чем явная МПК, можно не учитывать.

б) Методы серийных разведений в бульоне. Различают два основных варианта метода серийных разведений в бульоне: макрометод (пробирочный) и микрометод (при величине конечного объема 0,2 мл и меньше).

Рабочие растворы антибиотиков для макро- и микрометодов готовят по одинаковой схеме, аналогичной той, которая была описана для метода серийных разведений в агаре. Отличие заключается в том, что для приготовления используется не дистиллированная вода, а жидкая питательная среда. Необходимо также рассчитать концентрацию рабочего раствора антибиотика так, чтобы после инокуляции конечная концентрация антибиотика была равна заданной. Жидкую питательную среду, прошедшую предварительный контроль качества, готовят в соответствии с инструкцией изготовителя.

При постановке методов серийных разведений необходимо проводить контроль роста культуры в среде без антибиотика, а также контролировать качество с использованием референтных штаммов. Выбор референтного штамма определяется видом исследуемого микроорганизма.

Необходимо также контролировать чистоту суспензии микроорганизма, используемой для инокуляции, путем высева на неселективные среды.

Метод серийных макроразведений в бульоне. Наиболее распространенным способом постановки метода серийных макроразведений в бульоне является следующий. Рабочие растворы антибиотиков в жидкой среде готовят в асептических условиях, в концентрациях, в 2 раза превышающих заданные, и вносят по 1 мл в пробирки.

Суспензию исследуемого микроорганизма в концентрации 0,5 стандарта МакФарланда готовят из бульонной или агаровой культуры на стерильном изотоническом растворе. Затем ее разводят в жидкой питательной среде до концентрации 106 КОЕ/мл и вносят по 1 мл в пробирки с растворами антибиотиков. Таким образом, конечная концентрация микроорганизмов в инкубационной среде будет равна 5х105 КОЕ/мл.

Пробирки закрывают стерильными ватно-марлевыми пробками или металлическими колпачками и инкубируют при 37 °С в течение 16-20 ч.

Метод серийных микроразведений в бульоне легко поддается модификациям для разработки коммерческих тест-систем. При использовании коммерческих тест-систем следует пользоваться инструкциями изготовителей.

Постановка метода в системах, изготовленных в лабораторных условиях, во многом сходна с постановкой метода серийных макроразведений. Наиболее удобной посудой для постановки метода в лабораторных условиях являются 96-луноч-ные планшеты для иммунологических исследований. Значительным преимуществом метода микроразведений является возможность одновременного изготовления достаточно большого количества планшет, их хранения и использования по мере необходимости. Соответственно первым этапом является изготовление планшет, пригодных для хранения. Концентрацию рабочих растворов антибиотиков, вносимых в лунки планшет, рассчитывают исходя из схемы последующей инокуляции, которая должна основываться на необходимости создания в лунке конечной концентрации исследуемого микроорганизма 5х105 КОЕ/мл. После внесения рабочих растворов антибиотиков в лунки, запаянные в полиэтилен, планшеты могут храниться при температуре ниже —60 °С до момента использования. Повторное замораживание-оттаивание не допускается.

Для проведения исследования планшеты после извлечения из холодильника выдерживают до достижения ими комнатной температуры. Суспензию исследуемого микроорганизма готовят из агаровой или бульонной культуры по стандарту Мак-Фарланда и доводят до заданной концентрации.

Инокуляцию необходимо провести в течение 15 мин после приготовления суспензии. Ее осуществляют при 37 °С в течение 16-20 ч. Для предотвращения высыхания содержимого лунок планшета должна быть закрыта крышкой. Учет результатов при постановке макро- и микрометодов проводят визуально по появлению видимой мутности или спектрофоторметрически. За МПК принимают минимальную концентрацию, обеспечивающую полное подавление видимого роста.

Общие замечания по методам серийных разведений. Несмотря на то, что методы серийных разведений являются наиболее точными и информативными, их постановка в практических лабораториях сопряжена со значительными методическими трудностями. Прежде всего это необходимость использования антибиотиков с четко известным уровнем активности, соблюдения жестких низкотемпературных режимов хранения, контроля качества питательных сред, трудоемкость приготовления рабочих растворов антибиотиков. В то же время использование коммерческих тест-систем на основе метода серийных микроразведений позволяет избегать трудоемких процедур по стандартизации подготовительных этапов и обеспечивает получение достоверных количественных результатов по уровню антибиотикочувствительности.

Весьма экономичным и простым в исполнении является также вариант метода серийных микроразведений, основанный на использовании двух пороговых концентраций.

- Читать далее "Дисковый (диффузионный) метод оценки чувствительности к антибиотикам"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 11.07.2019

Все размещенные статьи преследуют образовательную цель и предназначены для лиц имеющих базовые знания в области медицины.
Без консультации лечащего врача нельзя применять на практике любой изложенный в статье факт.
Жалобы и возникшие вопросы просим присылать на адрес statii@dommedika.com
На этот же адрес ждем запросы на координаты авторов статей - быстро их предоставим.