ELISPOT — иммуноферментный тест с локальным связыванием для качественного выявления выработки антител и интерлейкинов на клеточном уровне в системе in vitro
Разработаны и нашли применение в клинической практике подходы к проведению иммунодиагностики инфекционных заболеваний на клеточном уровне. При этом оценивают интерлейкины или Ат, которые начинают вырабатываться лимфоцитами, выделенными из крови больного, в ответ на антигенную стимуляцию в системе in vitro.
Примером может служить новый лабораторный тест для диагностики туберкулеза CLINISPOT-TB, в основу которого положена методология ELISPOT. Принцип метода заключается в следующем. Из крови обследуемого выделяются лимфоциты в градиенте плотности (р=1,077) фиколл-верографина.
Затем их инкубируют со специфическим Аг M.tuberculosis (ТВ) in vitro в лунках иммуносорбента (96-луночного плоскодонного планшета) с адсорбированными на твердой фазе Ат к гамма-интерферону. Клоны эффекторных Т-лимфоцитов, существующие в организме инфицированных и больных туберкулезом людей, в ответ на антигенную стимуляцию начинают быстро продуцировать гамма-интерферон, который сразу же связывается с иммуносорбентом (на дне и стенках лунок). После инкубации лимфоциты и Аг удаляют, а иммуносорбент отмывают от неспецифических примесей.
На следующем этапе в лунки добавляют конъюгат, представленный Аг к гамма-интерферону, меченными ферментом пероксидазой. После соответствующей инкубации отмывают лунки от неспецифически связавшихся молекул конъюгата и вносят хромогенный субстрат (ДАБ) для визуализации иммунных комплексов. Положительные результаты проявляются в виде появления окрашенных пятен на дне лунок. Каждое пятно свидетельствует о наличии сенсибилизированного к ТВ клона Т-лимфоцитов, продуцирующего гамма-интерферон.
А — D. Этапы проведения ELISPOT:
А. Инкубация Т-лимфоцитов с Аг, выработка гамма-интерферона и его взаимодействие с иммуносорбентом (1 — моноклональные Ат к гамма-интерферону, 2 — Т-лимфоциты, 3 — Аг М. tuberculosis, 4 — гамма-интерферон);
В. Добавление конъюгата (5 — конъюгат, моноклональные Ат к гамма-интерферону);
С. Добавление субстратной смеси, реакция энзим-субстрат (6 — индикатор ДАБ);
D. Учет результатов. Появление на дне лунки окрашенных пятен (spots)
- Читать далее "Основные требования к иммунодиагностике инфекционных заболеваний методом ИФА"
Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 4.09.2019
- Количественное определение циркулирующих антител и антигенов (тест-системы на основе конкурентного ИФА)
- ELISPOT — иммуноферментный тест с локальным связыванием для качественного выявления выработки антител и интерлейкинов на клеточном уровне в системе in vitro
- Основные требования к иммунодиагностике инфекционных заболеваний методом ИФА