Дифференциация и идентификация возбудителей - определение родовой, видовой и типовой принадлежности микроорганизмов — наиболее ответственная часть микробиологического исследования. Оно осуществляется на основании изучения целого комплекса свойств: морфологических, тинкториальных, культуральных, ферментативных и антигенных.

Все расширяющийся спектр возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний требует изучения их по многим биохимическим показателям. Применяемые в настоящее время традиционные методы проведения микробиологического исследования не могут обеспечить необходимого его уровня в связи с трудоемкостью процесса приготовления дифференциально-диагностических сред, их многообразием, сложностью приобретения и дороговизной многих компонентов, отсутствием необходимой стандартности, большим расходом лабораторной посуды и т. д. Кроме того, продолжительность исследования в течение 4-7 дней практически обесценивает его значимость для конкретного больного.

Разработанные и внедренные в широкую практику коммерческие микротест-системы имеют несомненные преимущества перед традиционными методами исследования. Преимущества эти состоят в следующем:
— возможность одномоментного проведения широкого ряда биохимических реакций, что позволяет осуществить идентификацию, как правило, в один этап;
— значительное расширение спектра идентифицируемых микроорганизмов;
— сокращение продолжительности исследования, материальных и трудовых затрат;
— получение стандартных воспроизводимых результатов;
— математическая обработка данных;
— использование автоматизации при оценке результатов биохимических реакций.

Коммерческие микротест-системы, или слайды, для биохимической идентификации микроорганизмов различных групп - это готовые к использованию полистироловые планшеты или панели с сухими дифференцирующими средами. Следует отметить многообразие систем, которые выпускаются различными фирмами: bioMerieux (Франция), Becton Dickinson (США), Dade (США), PLIVA-Lachema (Чехия), НПО «Ставропольская медицинская академия» (РФ) и др.

В основе коммерческих тест-систем лежат различные модификации классического метода, включающего тесты для определения ферментации, ассимиляции, оксидации, деградации, гидролиза различных биосубстратов. В некоторые из них для ускорения процесса идентификации добавляют хроматогены или флюорохроматогены, которые могут быть выявлены химическими или флюорометрическими методами при помощи приборов. Коммерческие тест-системы позволяют проводить идентификацию большинства групп микроорганизмов. Ниже приведены тест-системы, наиболее известные в нашей стране.

Кроме того, широкое применение имеют диагностические полоски САЛМтест и КОЛИтест для ускоренной предварительной идентификации сальмонелл и кишечной палочки, ОКСИтест для выявления бактериальной цитохромоксидазы, ОНП тест для обнаружения бета-галактозидазы, ВПтест для определения продукции ацетоина (PLIVA-Lachema, Чехия).

а) Диагностические полоски и диски для идентификации стрептококков и энтерококков. PYRtest для дифференциации энтерококков и стрептококков, предварительной идентификации Str. pyogenes (производители — Oxoid; PLIVA-Lachema, Чехия);

Bacitracin S для предварительной идентификации Str. pyogenes (производители — Oxoid; PLIVA-Lachema, Чехия);

Оптохин для предварительной идентификации Str. pneumoniae (производители — Oxoid; PLIVA-Lachema, Чехия);

ТАХО Р для предварительной идентификации Str. pneumoniae (производитель - BBL, США);

ТАХО А для предварительной идентификации Str. pyogenes (производитель — BBL, США).

б) Диагностические диски:

X, V, X+V для дифференциации гемофильных бактерий (производители — PLIVA-Lachema, Чехия; BBL, США);

Bacitracin 10 ED для селективной изоляции гемофильных бактерий (производитель — PLIVA-Lachema, Чехия);

V+K для селективной изоляции N. meningitidis (производитель — PLIVA-Lachema, Чехия).

в) Общие правила работы с микротест-системами. Техника работы с микротест-системами проста и состоит из следующих этапов:

1. Выделение культуры:
• при идентификации микроорганизмов необходимо работать только с чистой культурой;
• по результатам первичного посева и данным микроскопии проводится дифференциация культур на грамположительные и грамотрицательные кокки и палочки для выбора тест-системы; при необходимости ставятся экспресс-тесты: определение каталазы, оксидазы.

2. Приготовление бактериальной суспензии:
• бактериальную суспензию готовят на физиологическом растворе, дистиллированной воде или суспензионной среде для определенных групп микроорганизмов из чистой 18-24-часовой культуры бактерий определенной степени мутности, по стандарту Мак-Фарланда. Тщательно гомогенизируют суспензию. Слишком густая или жидкая суспензия может привести к ложным результатам;
• параллельно делают контрольный высев суспензии культуры на кровяной агар для проверки чистоты культуры, ее ростовых свойств и/или для постановки дополнительных тестов.

3. Инокуляция:
• суспензию бактерий тщательно встряхивают и в необходимом объеме ино-кулируют в каждую лунку или ячейку в зависимости от вида тест-систем. При работе с планшетными тест-системами необходимо исключить возможность заражения соседних лунок;
• после инокуляции в определенные лунки для создания анаэробных условий добавляют стерильное вазелиновое (парафиновое) масло в соответствии с инструкцией.

4. Инкубация:
• инокулированные тест-системы инкубируют в термостате при рекомендованной в инструкции температуре в течение 2-48 ч, в зависимости от вида тест-системы. В ряде случаев для ускорения роста микроорганизмов культивирование проводят со встряхиванием тест-систем.

5. Оценка результатов:
• проверяют чистоту культуры по контрольному посеву;
• добавляют в определенные лунки необходимые реактивы, учитывают результаты биохимических реакций визуально при помощи таблиц «Интерпретация реакций» и/или цветных шкал и заносят их в бланки.

6. Идентификация (идентификацию проводят при помощи таблиц биохимической активности, профильных индексов, диагностических регистров — книг кодов или компьютерной программы):
• при окончательной идентификации следует учитывать всю дополнительную информацию (микроскопию, характер колоний, наличие пигмента, подвижность, источник выделения и т. д.);
• при идентификации при помощи таблиц биохимической активности проводят поиск вида культуры с аналогичными результатами реакций. Метод пригоден и достаточно достоверен для групп с малым количеством тестов и таксонов;
• идентификацию с использованием «ИНДЕКСОВ» применяют для определения вида бактерий путем вычисления их цифрового профиля. Это позволяет проводить стандартную интерпретацию результатов.

В «ИНДЕКСЫ» введено большинство возможных комбинаций тестов, используя которые можно идентифицировать типичные культуры, включенные в «Идентификационную таблицу».

Расчет профиля. Результаты биохимических реакций переводят в цифровой код — профиль. Для этого все тесты в биохимическом ряду разбивают на триады, в каждой из которых положительным результатам дают числовые значения: 1 тест — 1, 2 тест — 2, 3 тест — 4, все отрицательные результаты — 0. Суммируют числовые значения в триадах. Полученный числовой код соответствует профилю исследуемого микроорганизма. Например:

Полученный профиль 361 соответствует таксону Klebsiella pneumoniae.

Аналогично рассчитанный профиль используется для идентификации при помощи книг кодов (регистров). При этом для каждого таксона определяются два следующих показателя:

а) процент идентификации (%id.) —показывает, насколько полученный профиль соответствует идентифицируемому микробу по сравнению с другими таксонами, включенными в банк данных (%id. — критерий отличия микроба от других таксонов);

б) Т-индекс (Tin) — показывает соответствие профиля большинству типичных реакций данного таксона; значение этого показателя варьирует от 0 до 1 и обратно, пропорционально количеству атипичных тестов.

Книги кодов позволяют проводить достоверную идентификацию и в случае выявления 1-2 нетипичных для исследуемого вида результатов.

Контроль качества. Качество тест-систем контролируют при помощи референтных бактериальных культур, перечень последних приводится в инструкциях к тест-системам.

Наиболее частые причины неудач при идентификации:
• смешанная культура
• использование суспензий с недостаточной мутностью или в недостаточном объеме
• перекрестная контаминация суспензий в расположенных рядом лунках
• соответствующие лунки не заполнены парафиновым маслом
• попадание реактивов в соседние лунки (ячейки)
• не точно соблюдена методика постановки теста
• отсутствие анаэробной атмосферы при культивации анаэробных бактерий
• возможно выделение штамма с нетипичными свойствами или его данные не заложены в таблицы.

При получении несовпадающих результатов при работе с тест-системами разных производителей, в сомнительных случаях и при получении заключения о выделении редко встречающихся видов микроорганизмов для окончательной верификации культуры необходима проверка ее либо в референтных лабораториях, либо проведение повторной идентификации классическим методом с использованием традиционно приготовленных дифференциально-диагностических сред в комплексе с оценкой морфологических, тинкториальных, культуральных и других свойств.

Накопленный опыт работы с коммерческими тест-системами показал:
— уникальность тест-систем, включающих различные спектры биохимических тестов для одних и тех же групп микроорганизмов;
— возможность различного проявления одних и тех же ферментативных реакций при культивировании одних и тех же культур в различных тест-системах;
— необходимость использования для контроля качества работы тест-систем музейных штаммов, рекомендованных фирмой производителем;
— в банках к тест-системам встречаются различные наименования одних и тех же таксонов, что необходимо учитывать при проведении идентификации.

- Читать далее "Автоматизация и компьютеризация при проведении микробиологических исследований"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 4.09.2019