Постоянно осуществляемый микроорганизмами синтез клеточных компонентов стимулирует рост клеток и последующее их размножение.

Рост клеток — это процесс увеличения размеров, объема, массы каждой отдельной особи в ходе индивидуального развития, обусловленный синтезом клеточного материала. Рост начинается после деления клетки, которая быстро достигает стадии зрелости, а затем приступает к размножению или переходит в стадию покоя. Рост характерен для всех групп микроорганизмов, кроме вирусов. Его изучают на изолированных клетках.

Размножение микроорганизмов — процесс самовоспроизведения, обеспечивающий существование вида. Для микробов характерны исключительно высокие темпы размножения в благоприятных условиях. В неблагоприятных условиях размножения не происходит, и микроорганизмы гибнут или переходят в стадию покоя. Способы и скорость размножения обусловлены геномом микроба и соответствием условий обитания его генетическим потребностям. Способы размножения у микроорганизмов разнообразны: бинарное деление — у большинства бактерий, почкование, спорообразование, половой процесс и др. — у грибов и дрожжей, особые способы размножения — у простейших (множественное деление, половое и др.).

При бинарном делении из одной бактериальной клетки без предварительного обмена генетической информацией образуются две равноценные дочерние особи. Инициатором деления является кольцевая ДНК бактерии, которая прикреплена к определенному участку ЦПМ. Репликация ДНК наступает в определенной фазе роста под контролем гена-регулятора и гена-репликатора. Вновь образованная ДНК оказывается прикрепленной к соседнему участку ЦПМ. Между участками прикрепления исходной и новообразованной ДНК строго по экватору формируется перетяжка (у грамотрицательных бактерий) или перегородка (у грамположительных бактерий). После разделения дочерние клетки расходятся или формируют колониальный организм в виде цепочек, гроздьев, пакетов и др. В норме рост и размножение строго сбалансированы и последовательны. В неблагоприятных условиях при продолжающемся росте может не наступить размножения (несбалансированный рост).

От роста клеток следует отличать рост популяции — необратимое увеличение количества живого вещества (биомассы), обусловленное увеличением клеточной массы и количеством клеток в единице объема питательной среды. Для определения количества биомассы пользуются следующими критериями.

Закономерности роста популяции зависят от условий культивирования микроорганизмов. Они различны при росте в разных закрытых системах: в пробирках, колбах с жидкой питательной средой, в которых не возобновляются питательные вещества (периодическая статическая культура),ив закрытой системе хемостата или турбидостата, в которые подается свежая питательная среда, удаляется часть микробов с продуктами обмена и корригируется pH (открытая, непрерывная культура ).

Скорость размножения микроорганизмов самая большая среди всех живых существ, обитающих на Земле. Е. coli в оптимальных условиях начинает делиться через 20 мин. Высчитано, например, что если одна кокковая бактерия диаметром 1 мкм будет беспрепятственно размножаться с присущей ей скоростью, то уже через 65 ч количество этих бактерий достигнет объема, равного величине земного шара. Микроорганизмы размножаются быстрее человека в 250-300 тыс. раз.

В условиях периодического (статического) культивирования популяция микроорганизмов развивается по определенным закономерностям, которые графически можно изобразить в виде кривой роста. На ней отчетливо различается несколько фаз роста, следующих друг за другом в определенной последовательности:

• начальная — лаг-фаза (англ, lag — запаздывать, отставать) — период адаптации, привыкания клеток к новой среде, сопровождающийся индукцией соответствующих ферментов и значительным увеличением количества РНК. Продолжительность этой фазы (в среднем 4-5 ч) зависит от возраста инокулята, качества питательной среды и температуры культивирования. На средах, содержащих смесь субстратов (например, глюкозу и арабинозу — при выращивании Е. coli), наблюдается две лаг-фазы (двухфазный рост) — явление диуаксии, или катаболитной репрессии. Это объясняется тем, что синтез и использование ферментов идет последовательно: сначала — конститутивные, а затем индуцибельные. Поэтому из двух субстратов первой используется глюкоза, катаболизм которой осуществляется конститутивным ферментом, и только потом — арабиноза;

• фаза экспоненциального (логарифмического) роста (лог-фаза), характеризующаяся активным ростом и делением клеток с максимальной скоростью и минимальным временем генерации. Отмечается общее увеличение микробной массы. При росте в экспоненциальной фазе увеличение числа клеток происходит в геометрической прогрессии: 2⁰ → 2¹ → 2² → ... → 2ⁿ. Обычно такие клетки используют в биохимических и физиологических исследованиях. Конец этой фазы — вершина накопления клеток в культуре. Количество биомассы, достигнутое к началу следующей фазы, называют урожаем (выходом). Его определяют как разность между максимальной и исходной массой бактерий, внесенных в среду с инокулятом. Урожай выражают в граммах. Продолжительность этой фазы у Е. coli в среднем — 5-12 ч. К концу этой фазы отмечается замедление темпов роста популяции;

• стационарная фаза — наступает тогда, когда число клеток в популяции перестает увеличиваться. Общее количество клеток в единице объема среды в этот период обозначают как М (максимальную)-концентрацию. М-концентрация для каждого вида микроорганизмов является величиной постоянной и не может быть превышена. Для бактерий это в среднем 10⁹ кл/мл, для простейших — 10⁶ кл/мл. Процессы деления и отмирания клеток в популяции находятся в динамическом равновесии. В дальнейшем происходит уменьшение субстрата в питательной среде, нарастает плотность бактериальной массы, снижается парциальное давление кислорода, накапливаются токсические продукты обмена, что отрицательно сказывается на процессах роста, у некоторых бактерий начинается процесс споруляции;

• фаза отмирания, когда общее количество жизнеспособных клеток постепенно уменьшается. Гибель клеток наступает в результате действия многих факторов, один из которых — исчерпание запасов энергии в них. В эту фазу изменяется морфология клеток, появляются инволюционные формы, изменяются биохимические и антигенные свойства, повышается устойчивость к антисептикам, усиливается спорообразование и др. Культура постепенно погибает.

Рост микроорганизмов на плотных питательных средах подчинен тем же закономерностям, что и рост в жидких средах, однако выход биомассы оказывается значительно большим.

Если при культивировании происходит пропорциональное увеличение всех веществ и структур клеток, рост микроорганизмов считают сбалансированным. Если же в среде отмечается нехватка или избыток каких-либо ингредиентов, то рост становится несбалансированным, при этом какие-то продукты метаболизма могут преобладать. Это используется для направленного синтеза определенных соединений.

Чтобы правильно оценивать рост культуры, необходимо определять количество клеток и увеличение биомассы. Для подсчета общего количества бактерий в популяции пользуются следующими методами:

• подсчетом в микроскопе в тонком слое среды при помощи «счетной камеры» (например, Петроф-Хаузера, Горяева и др.). Счетная камера — это специальное предметное стекло, на котором начерчены квадраты известной площади, покрытое тонким покровным стеклом. Между предметным и покровным стеклами можно поместить слой жидкости известной толщины. Если толщина слоя составляет 0,02 мм, сторона квадрата 0,05 мм (объем 5x10^-8 см³), то найденное число клеток надо умножить на 2x10⁷. Данным методом можно анализировать суспензии, содержащие не менее 10 млн кл/мл;

• методом мембранных фильтров при количестве клеток менее 10⁶ на 1 мл среды. После фильтрации фильтр высушивают, окрашивают и производят подсчет клеток под микроскопом;

• подсчетом с использованием электронного счетчика Колтера, в котором регистрируются отрицательные заряды поверхности каждой микробной клетки.

Для учета количества жизнеспособных клеток в культуре определяют число колониеобразующих единиц в 1 мл среды (КОЕ/мл), основываясь на положении, что одна колония вырастает из одной бактериальной клетки. При использовании чашечного метода Коха разбавленную гомогенную суспензию клеток смешивают с равным количеством расплавленной агаризованной среды (40-43 °С) и выливают в чашки Петри. Можно сделать посев шпателем Дригальского на поверхность чашки Петри, внеся дозировано 1 мл суспензии микробных клеток (в 3 повторностях). После инкубации в термостате подсчитывают количество колоний в 1 мл исходного материала (КОЕ/мл). Желательно суспензию бактерий приготовить таким образом, чтобы на чашке Петри вырастало не более 100-150 колоний.

Для оценки урожая биомассы проводят взвешивание «сырых» клеток после центрифугирования или «сухих», которые получают высушиванием «сырых» клеток при 100 °С. При определении интенсивности обмена или ферментативной активности исходят из содержания белка (по Лоури) или общего азота (микро-диффузионный метод определения аммиака).

К косвенным методам определения биомассы относятся методы, основанные на измерении мутности клеточных суспензий. Используют метод определения оптической плотности суспензии (турбидиметрия) или метод определения рассеяния света (нефелометрия).

Определение числа клеточных делений за 1 ч (константа скорости деления) проводят по формуле:

где n — число делений клеток; t₀ и t — время начала и конца делений;

IgN - IgN₀ — разность логарифмов конечного и начального числа клеток на единицу объема статической культуры после n делений.

Время, требующееся для одного цикла делений, или время генерации (g), равно:

Так, например, если за 10 ч число клеток в суспензии возрастает с 10³ до 10⁹, то это значит, что константа скорости деления равна:

а время генерации равно 1/2 ч.

Для большинства бактерий время генерации составляет 20-30 мин (например, у бактерий кишечной группы), у некоторых оно больше. Так, например, время генерации у туберкулезных бактерий равно 18 ч, у лептоспир — 14 ч.

Константу скорости роста (р) определяют по формуле:

где х — плотность бактериальной суспензии; dx — прирост количества биомассы за бесконечно малый промежуток времени (г/мл или кл/мл); dt —период наблюдения.

Отсюда время удвоения бактериальной массы t_d = g.

Урожай (или выход) биомассы определяют по формуле:

где Х_max — масса (число) клеток, вступившая в стационарную фазу;

Х₀ — масса (число) клеток, внесенных в среду с инокулятом.

Важное значение имеет экономический коэффициент, который характеризует отношение урожая клеток к количеству потребленного субстрата:

где S — количество потребленного субстрата в граммах.

- Читать далее "Влияние физиких и химических факторов на рост микроорганизмов"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 16.05.2019