Питательные среды, тесты, реактивы для выделения и идентификации стрептококков

а) Основа питательных сред для стрептококков — бульон Тодда-Хьюитта (Todd-Hewitt). Измельчают бычье сердце и на каждые 450,0 г фарша добавляют по 1000,0 мл дистиллированной воды. Оставляют на ночь при температуре 4°С. Настой нагревают до 80-С и выдерживают при этой температуре 30 мин, периодически помешивая. Горячий мясной настой фильтруют через фильтровальную бумагу или вату. Потерю жидкости за счет испарения и фильтрации восполняют дистиллированной водой. На каждый литр настоя добавляют по 20,0 г пептона и доводят pH гидроксидом натрия NaOH (1 ммоль/л, т. е. примерно 3,0 мл на 1 литр смеси). На каждый литр среды добавляют 2,0 г натрия бикарбоната NaHCO3, 2,0 натрия хлорида и 1,0 г натрия гидроортофосфата (Na2HPO4 12 Н2O).

Кипятят среду 15 мин. Горячую среду фильтруют через фильтровальную бумагу. Доводят pH до 7,8±0,2, разливают среду по флаконам и стерилизуют при 115°С 10 мин. Хранят в холодильнике.

б) Бульон для накопления и выделения стрептококка группы В. Состав:
• Гидролизат мяса по Хоттингеру — 40,0 мл;
• триптон или пептон из казеина триптический — 20,0 мг;
• глюкоза — 2,0 г;
• NaHCO3 - 2,0 г;
• NaCl - 2,0 г;
• Na2HPO4 - 0,4 г;
• дистиллированная вода до 1 литра.

Аминный азот среды: 1,3-1,4 г/л., pH после стерилизации: 7,4 -7,6. Режим стерилизации: 0,5 атм., 112°С, 30 мин. В стерильный бульон вносят 5% лошадиной сыворотки и антибиотики: рабочий раствор налидиксовой кислоты (1,0 г/мл) — 1,36 мл, рабочий раствор гентамицина (1,0 г/мл.)

Бульон разливают по пробиркам, проверяют на стерильность. Срок хранения 15-20 дней в холодильнике (t°= 2-6°C).

в) Селективный бульон для накоплении и выделения стрептококка группы В на основе бульона Тодда-Хьюитта. В стерильный бульон Тодда-Хьюитта вносят растворы антибиотиков:
• рабочий раствор (1,0 г/мл) налидиксовой кислоты — 1,36 мл,
• рабочий раствор (1,0 г/мл) гентамицина — 0,73 мл.

Разливают в пробирки. После проверки на стерильность (на 18-24 часа помещают в термостат при 37°С) бульон может храниться в холодильнике 15-20 дней.

в) Тест на гидролиз гиппурата натрия для идентификации стрептококка группы В. Тест основан на способности стрептококков серогруппы В вызывать гидролиз гиппурата натрия, после чего при взаимодействии с раствором хлорида железа образуется нерастворимый осадок бензоата железа. Существует несколько вариантов постановки этого теста.

1. В пробирку с питательным бульоном (можно использовать любой питательный бульон с показателем аминного азота 1,3-1,4 г/л), содержащим 1 % гиппурата натрия, вносят исследуемую 18-часовую культуру. Через 24-96 ч инкубации при 37-С получают бесклеточный центрифугат. Отбирают 0,8 мл надосадка, к которому добавляют 0,2 мл хлорида железа. При положительной реакции наблюдают появление нерастворимого желто-коричневого осадка.

Реагент хлорида железа для этого теста готовят следующим образом: 12,0 г FeCl3*6H2O вносят в 100 мл 2%-ного раствора соляной кислоты (94,6 мл дистиллированной воды и 5,4 мл концентрированной 37 %-ной соляной кислоты).

Можно использовать коммерческую среду — «Бульон для гидролиза гиппурата» («HiMedia», «Hippurate Hydrolysis Broth»)

2. Экспресс-метод гидролиза гиппурата натрия в пробирках (Mei-Na Hwang, G. М. Ederer, 1985). Петлю культуры стрептококка, выращенной на кровяном агаре, суспендируют в 0,4 мл 1 %-ного водного раствора гиппурата натрия. Через 2 ч. инкубации при 37°С вносят 0,2 мл раствора нингидрина (3,5 г нингидрина в 100 мл смеси ацетона и бутанола в равном соотношении) и инкубируют еще 10 мин. Появление сине-пурпурного окрашивания свидетельствует о положительной реакции.

3. Экспресс-метод гидролиза гиппурата натрия на полосках фильтровальной бумаги (Р. Mudd, 1983). Полоски фильтровальной бумаги пропитывают раствором из равных объемов 1%-ного водного раствора гиппурата натрия и нингидринового реагента. В поверхность высушенной фильтровальной бумаги втирают материал из одной исследованной колонии стрептококка и оставляют при комнатной температуре на 10 мин. При положительной реакции появляется темно-пурпурное окрашивание.

г) Среда для выявления способности стрептококков гидролизовать углевод эскулин. Состав:
• эскулин — 1,0 г,
• пептон — 10,0 г,
• экстракт мясной — 10,0 г,
• натрий хлорид — 5,0 г,
• железо (III) цитрат — 0,5 г,
• дистиллированная вода — до 1000,0 мл.

Ингредиенты смешивают, подогревают до растворения, устанавливают pH 7,1±0,1, разливают в пробирки по 3-5 мл. Стерилизуют при 112°C 30 мин. При гидролизе эскулина отмечают окрашивание среды в черный цвет.

д) Плотная среда с крахмалом. Состав:
• пептон —1,0 г,
• натрия хлорид (NaCl) — 0,5 г,
• крахмал — 0,5—1,0 г,
• агар — 1,5 г,
• вода дистиллированная — 100,0 мл.
• рН-7,4±0,2

Среду стерилизуют автоклавированием при 112°С в течение 30 мин Перед использованием к расплавленному и остуженному до 45°С агару добавляют 10% сыворотки животных.

Разливают в стерильные чашки Петри. Штрихом или бляшками производят посев 18-часовой агаровой культуры. Посевы инкубируют в течение 24-48 ч. при 37°С. При гидролизе крахмала вокруг роста культуры (штриха, бляшки) появляется зона просветления среды. Она лучше выявляется после обработки среды раствором Люголя. При этом вся среда окрашивается в синий цвет, кроме зоны гидролиза крахмала, которая остается прозрачной.

е) Желче-эскулиновый агар (ЖЭА) для ориентировочной идентификации стрептококков группы D и энтерококков. К 100 мл стерильного расплавленного и охлажденного до 45°С агара на переваре Хоттингера (или на сухом питательном агаре), содержащего 4 % желчи и 0,05 % хлорида железа (FeCl3*6H2O) асептично добавляют 10 мл стерильного 1%-го раствора эску-лина. Среду стерильно разливают в чашки Петри или в пробирки (для скашивания).

Испытуемые штаммы засевают штрихами на поверхность агара, инкубируют 24-48 ч. При положительном результате отмечается рост стрептококков и гидролиз эскулина, что сопровождается почернением среды.

Можно использовать готовый коммерческий ЖЭА (Oxoid, Pronadisa, BBL и др.).

ж) Тест на толерантность к 6,5%-ным хлорида натрия для дифференциации энтерококков и стрептококков группы D. В качестве основы используется любой питательный бульон для стрептококка. К 1000 мл бульона добавляют:
• хлорид натрия (NaCl) — 65,0 г,
• 1,6 %-ный раствор бромкрезолового пурпурного в 95%-ом этаноле — 10 мл,
• глюкоза — 1,0 г,
• дистиллированная вода — до 1000,0 мл.
• рН-7,2±0,2

Среду разливают в стерильные пробирки, стерилизуют автоклавированием 15 мин при 121°С. Стерильная среда имеет пурпурный цвет.

Посевы стрептококков выдерживают при 35°С 24, 48 и 72 ч. Видимый рост бактерий в виде помутнения среды без изменения ее цвета или изменение цвета среды в желтый оценивают как положительный результат теста.

з) Среда для выявления разложения аргинина. Состав:
• пептон — 5,0 г,
• бычий экстракт — 5,0 г,
• пиридоксин — 0,005 г,
• L-аргинин — 10,0 г (если используется D- или DL-аргинин, то навеска составляет 20,0 г),
• глюкоза — 0,5 г,
• 1,6 %-ный раствор бромкрезолового пурпурного — 0,625 мл,
• 0,2%-ный раствор крезолового красного — 2,5 мл,
• дистиллированная вода — 1000 мл.

Ингредиенты растворяют, доводят pH до 6,5±0,5, среду разливают в пробирки по 3 мл, стерилизуют при 121°С 10 мин.

Приготовление раствора бромкрезолового пурпурного: 1,6 г красителя растворяют в 100 мл 95°-ного этанола.

Приготовление 0,2% раствора крезолового красного: измельчают в пудру 0,5 г порошка красителя при добавлении 26,2 мл 0,01 N NaOH и доводят объем до 250 мл дистиллированной водой.

Сразу после посева испытуемой культуры среду заливают стерильным минеральным маслом (около 10 мл), инкубируют при 35°С 7 дней. При разложении аргинина появляется фиолетовое окрашивание. Отрицательный результат, который проявляется желтым окрашиванием, свидетельствует о ферментации только глюкозы.

Можно воспользоваться коммерческой средой с аргинином (среда Moeller).

- Читать далее "Среды, тесты для выделения и идентификации энтерококков"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 4.6.2020

Остались вопросы или замечания?

Все размещенные статьи преследуют образовательную цель и предназначены для лиц имеющих базовые знания в области медицины.
Без консультации лечащего врача нельзя применять на практике любой изложенный в статье факт.
Жалобы и возникшие вопросы просим присылать на адрес statii@dommedika.com
На этот же адрес ждем запросы на координаты авторов статей - быстро их предоставим.