Второй этап изучения антидетерминанты — доказательство самосборки активного центра при реконструкции молекулы антитела из изолированных цепей (Ф. Франек, Р. Незлин, 1964; J. Edelman, 1963). Тогда же была продемонстрирована возможность спонтанной реконструкции антидетерминанты из полипептидных цепей, развернутых предварительно под влиянием денатурирующих агентов в присутствии восстановителей (М. Fridman, M. Sela, 1966). Именно с этого момента можно считать окончательно утратившими значение идеи о прямом участии антигена (гаптена) в формировании полости антидетерминанты.

Третий этап — создание метода «метки по сродству» с целью идентификации аминокислотных остатков непосредственно в активном центре (L. Wofsy, H. Metzger, S. Singer, 1962—1964). Сущность метода состоит в том, что гаптен в форме реакционноспособного производного, связываясь с высокой скоростью в активном центре специфичного к нему антитела, обеспечивает взаимодействие реакционноспособной группы с радикалами непосредственно в активном центре.

К настоящему времени синтезировано большое число различных реакционноспособных производных гаптенов, избирательно реагирующих с разными аминокислотными остатками. В ходе реакции образуются устойчивые ковалентные связи, поэтому, разделив полипептидные цепи и фрагментировав их, можно точно локализовать меченый аминокислотный остаток.

Таким способом удалось установить, что оба вариабельных домена (от легкой и тяжелой цепей) участвуют своими аминокислотными остатками в формировании полости активного центра и что полость центра «выстилают» отрезки цепей, соответствующие гипервариабельным участкам. Данные, накопленные с помощью метода «метки по сродству», были дополнены результатами, полученными методами дифференциальной спектрофотометрии и электроннопарамагнитного резонанса, а также химической модификации определенных аминокислотных остатков в молекуле антитела.

Для ряда гаптенов гидрофобного характера (например, нитрофенильные производные) было доказано присутствие в активном центре антитела остатка триптофана, продемонстрирован гидрофобный характер полости антидетерминанты. Для других гаптенов установлена локализация остатков гистидина, лизина, тирозина и точно определено их местоположение в каждой цепи.

Заключительный этап изучения антидетерминанты — получение в кристаллической форме Fab-фрагментов моноклональных иммуноглобулинов, специфически связывающих определенные гаптены, и рентгеноструктурныи анализ кристаллов, образованных комплексами фрагмента антитела с соответствующим гаптелом. В этих исследованиях, выполненных в последние годы, были подтверждены и развиты представления, сформулированные на основании многих работ по структуре антител.

Рентгеноструктурный анализ подтвердил участие гипервариабельных сегментов в формировании полости антидетсрминанты. Примером может служить изучение Fab-фрагмента моноклонального миеломного иммуноглобулина человека New, который в числе ряда лигандов связывает также гидроксильное производное витамина K, имея к этому лиганду сравнительно высокое сродство (Kа= 105М-1). Гипервариабельные участки образуют неглубокие выемки, так что центр имеет размеры 1,6X0,7 нм2 при глубине 0,6 нм.

Ароматическая менадионовая группа гаптена находится в непосредственном контакте с остатками ароматических аминокислот: тирозином и триптофаном. Этим остаткам принадлежит, очевидно, основная роль в «удержании» менадионовой группировки (2-метил-1,4-нафтохинон) в полости активного центра.

- Читать далее "Гипервариабельные участки иммуноглобулинов. Конфигурационная ассиметрия участков иммуноглобулинов"