Полиовирусный РП, впервые обнаруженный Балтимором и Жираром (1966) и окончательно идентифицированный Балтимором (1968b) и Бишопом и др. (1969), обладает всеми свойствами, которыми должна обладать структура, описан ная Вайсманом и др. (1968) и Спигелменом и др. (1968). В табл. 6-2 перечислены эти свойства и приведено сравнение РП с одноцепочечной вРНК и с двухцепочечной РФ, впервые описанной Монтанье и Сандерсом (1963).

РП можно отделить от мРНК, кРНК. и РФ фильтрованием через агарозные гели и хроматографией на бензоилированной ДЭАЭ-целлюлозе (обзоры: Бишоп и Левинтоу, 1971; Монтанье, 1968). Он содержит одну полную цепь (обычно кРНК, иногда вРНК), на которой одновременно растут примерно 6—7 комплементарных цепей. Транскрипция начинается с З'-конца матрицы. Каждая дочерняя цепь с помощью водородных связей образует комплементарные пары оснований с матрицей лишь на коротком участке возле растущего конца.

Молекула полимеразы, находящаяся на этом растущем конце, вероятно, играет важную роль в удержании цепей друг около друга. 5'-конец каждой растущей цепи быстро отделяется от матрицы и образует свободный одноцепочечныи «хвост». Эти хвосты можно искусственно удалить из РП рибонуклеазой I, и тогда останется частично двухцепочечная структура, содержащая одну интактную цепь, соединенную водородными связями с несколькими более короткими последовательностями, между которыми находятся пробелы.

Нагревание РП приводит к двухфазному гиперхромному эффекту: при относительно низких температурах постепенно денатурируют одноцепочечные ветви; затем, когда температура достигает ТПл двухцепочечной РФ, происходит разрушение водородных связей. Анализ показал, что большая часть полных одноцепочечных матриц представляет собой кРНК (о чем свидетельствует их способность гибридизоваться с вРНК), тогда как короткие фрагменты гетерогенной длины в основном имеют полярность вРНК. Другими словами, синтез РНК асимметричен, т. е. цепи вРНК образуются в 5—10 раз быстрее, чем цепи кРНК (Бишоп и Левинтоу, 1971).

Неизвестно, участвует ли в этом процессе некий регуляторный механизм или преобладание кРНК-матриц в составе РП является неизбежным следствием вовлечения мРНК в процессы трансляции и образования вирионов. Неясно также, осуществляется ли синтез цепей вРНК на матрице кРНК и синтез цепей кРНК на матрице вРНК различными полимеразами или обе функции выполняет один и тот же фермент, как это происходит у фага Q (Миллс и др., 1966).

Купер и др. (1970а, 1971) представили генетические доводы в пользу существования двух ферментов: полимераза I, закодированная на 3'-конце генома, предположительно является ферментом, катализирующим образование цепи кРНК на матрице вРНК; полимераза II (NCVPX), вероятно, кодируемая коротким участком в середине генома, возможно, синтезирует цепи вРНК на матрицах кРНК.

РП накапливается с экспоненциально возрастающей скоростью в течение нескольких начальных часов инфекции (Балтимор и Жирар, 1966). Наиболее надежные доказательства того, что РП действительно функционирует как промежуточная структура при репликации вирусной РНК, получены на основании экспериментов с импульсной меткой и последующим вытеснением ее избытком немеченого субстрата; радиоактивная метка быстро обнаруживалась в составе РП, а затем переходила в дочерние одноцепочечные молекулы (Жирар, 1969; Мак-Доннел и Левинтоу, 1970).

РФ с типичной спиральной двухцепочечной структурой накапливается в умеренных количествах лишь на поздних стадиях инфекционного цикла (Балтимор и Жирар, 1966) и является нефункциональным конечным продуктом репликации вирусной РНК (Балтимор, 1968b; Жирар, 1969). Более того, убедительно доказано, что двухцепочечный материал, выделенный из зараженных клеток в большом количестве, — артефакт, обусловленный спонтанным отжигом одноцепочечных комплементарных цепей in vitro после экстракции (Вайсман и др., 1968).

Эбергу и Филипсону (1971) удалось избежать артефакта, связанного с отжигом, добавляя перед фенольной экстракцией РНК диэтилпирокарбонат. В данной работе было окончательно опровергнуто предположение о консервативном механизме репликации полиовирусной РНК, т. е. транскрипции одиночных цепей на двухцепочечной матрице; этот процесс, без сомнения, имеет полуконсервативный механизм.

- Читать далее "Сборка пикорнавирусов. Этапы сборки пикорнавирусов"