Советуем для ознакомления:

Разделы генетики:

Популярные разделы сайта:

Оглавление темы "Физическое картирование генов.":
1. Физическое картирование генов. Картирование генов с помощью хромосомных мутаций.
2. Картирование генов с помощью гибридизации in situ.
3. Гибридизация соматических клеток и картирование генов человека.
4. Идентификация генов человека с помощью позиционного клонирования.
5. Создание моделей наследственных болезней. Создание трансгенного животного.

Гибридизация соматических клеток и картирование генов человека.

Для физического картирования широко используют методы гибридизации соматических клеток.

Обычно для гибридизации с клетками человека применяют соматические клетки грызунов, чаще всего мыши. Для того чтобы облегчить слияние клеток разных видов, в культуральную среду добавляют вирус Сендай, инактивированный ультрафиолетовым облучением, или полиэтиленгликоль. Для отбора слившихся клеток от исходных клеток человека и мыши клетки выращивают на специальной селективной среде, которая позволяет размножаться только гибридным клеткам (для этого в опытах по слиянию использовали линии клеток мышей с недостаточностью по некоторым ферментам, чаще всего с недостаточностью по тимидинкиназе).

В только что образовавшихся гибридных клетках ядра содержат оба набора хромосом человека и мыши. Однако последующее размножение гибридных клеток приводит к постепенной утрате хромосом человека у гибридов, поэтому в результате остается только одна или даже фрагмент одной из хромосом человека. Когда метод гибридизации соматических клеток был только создан, то тестировалось присутствие в гибридных клетках, в которых осталась одна или несколько хромосом человека, ферментов и других белков человека, которые по своим характеристикам отличались от соответствующих белков мыши, или клетки мыши были дефицитны по каким-то ферментам.

Гибридизация соматических клеток и картирование генов человека

Обычно из гибридов соматических клеток создавали панели, в которых присутствовали хромосомы человека в минимальных количествах и в самых разных комбинациях. Поэтому для установления локализации гена соответствующего фермента или другого белка человека не было необходимости применять только те гибриды соматических клеток, которые содержали лишь одну хромосому человека.

Вместе с тем сначала можно было картировать только гены человека, проявляющиеся на клеточном уровне, и невозможно было работать с генами, имевшими сложное феноти-пическое проявление, при котором первичный дефект оставался неизвестным. Методы молекулярной генетики позволили решить эту проблему, и в настоящее время с помощью ПЦР, блоттинга по Саузерну и иных молекулярно-генетиче-ских методов можно тестировать гибридные соматические клетки на наличие в оставшихся хромосомах человека любых генов независимо от того, известен ли продукт этих генов или нет.

Недостатком метода картирования генов человека с помощью гибридных соматических клеток было то, что часто локализация генов устанавливалась с точностью до хромосомы. Разрешающие возможности в картировании генов таким путем были, следовательно, ограничены.

Однако если в гибридных клетках осталась только одна хромосома человека, то, облучив такие гибридные клетки рентгеновскими или гамма-лучами, можно добиться фрагментации этой хромосомы и после получения новых гибридных клеток с помощью дополнительного слияния с клетками грызунов (после облучения гибридные клетки без дополнительного слияния с клетками грызунов погибают) уточнить локализацию интересующего исследователей генов вплоть до небольшого фрагмента определенной хромосомы (картирование с помощью радиационных гибридов). Особенностью радиационных гибридов является то, что образующиеся после облучения фрагменты хромосомы человека не способны проходить митоз и теряются, если они не сливаются с хромосомами мыши.

Эти фрагменты человеческих хромосом могут быть столь небольшими по размеру, что уже не обнаруживаются цитологически. Поэтому до проведения опытов по картированию необходимо специальными методами, в частности с использованием ДНК-полиморфных маркеров (обычно применяют Alu-полиморфизм, отсутствующий у мыши), уточнить, какие фрагменты определенной хромосомы человека сохранились в радиационных гибридах. Еще одной особенностью радиационных гибридов является то, что на них можно изучать сцепление между генами во фрагментах хромосом человека и даже оценивать генетическое расстояние между сцепленными локусами, исходя из того, насколько часто они присутствуют во фрагментах вместе или раздельно. При этом предполагают, что чем ближе расположены гены друг к другу на хромосоме, тем реже радиационно индуцированные разрывы в хромосоме будут разделять сцепленные гены.

- Читать далее "Идентификация генов человека с помощью позиционного клонирования."