Диагностика энтероклостридиозов диффициле (C. difficile)

а) Клиническая диагностика. Диагностика ЭКД складывается из анализа совокупности данных анамнеза, клинических, эндоскопических и лабораторных исследований.

Анамнестические данные позволяют заподозрить ЭКД у пациентов, получавших антибиотики последние 2 месяца, или с возникшей диареей спустя 2-3 суток после госпитализации.

Общеклинические методы исследования, такие как анализы крови, мочи, кала, могут нацелить на воспалительный характер диареи.

Инструментальные клинические исследования кишечника, такие как рентгенологическое, ультразвуковое, компьютернотомографическое не могут служить решающим основанием для постановки диагноза, ибо, ввиду сложности и малодоступности оборудования, эти исследования проводятся нерегулярно и результаты их пока не поддаются систематизации.

Эндоскопические исследования кишечника (ректосигмоидоскопия, колоноскопия, ирригография) являются достаточно доступными и позволяют оценить степень выраженности морфологических изменений кишечной стенки под воздействием патогенетических факторов С. difficile при любых формах ЭКД.

Патоморфологические изменения в кишечнике очень четко подтверждают диагноз и степень развития симптомов при ПМК, начиная от гиперемии и отечности слизистой оболочки до формирования псевдомембран, представляющих собой бело-желтые возвышающиеся бляшки диаметром до 10 мм, имеющие тенденцию к слиянию.

Эти изменения патогномоничны для ПМК и, по данным многих авторов, подтверждены положительными результатами обнаружения возбудителей ЭКД.

б) Лабораторная диагностика:

1. Клинические материалы для лабораторного исследования. При всех клинических формах ЭКД основным материалом для анализа является свежевзятый кал в количестве 5 мл или 5 г., жидкие испражнения в объеме 10-20 мл. Взятие материала производится на пике диареи, желательно с помощью мягкой пипетки (канюли) прямо из прямой кишки. Одновременно можно сделать мазки или взять биоптаты со слизистой оболочки кишки.

Нативные образцы материалов должны транспортироваться в стерильных герметичных пластиковых или стеклянных контейнерах и в течение трех часов подвергаться анализу. Допускается хранение исходных материалов при +4°С не более 48 часов, при минус 20°С — в течение длительного времени.

При наличии «транспортных» питательных сред для анаэробов можно сразу сделать высев материалов на среды и отправить их на исследование. В зависимости от того, какие методы лабораторного анализа будут применяться, проводится соответствующая подготовка исследуемого материала.

Для токсикологического исследования с помощью цитопатогенного теста (ЦПТ) получают бесклеточный супернатант исходных материалов путем последовательного центрифугирования при 6-7 тыс. об. с охлаждением, а затем микрофильтрации через фильтры «Millipore» с величиной пор 0,22-0,45 мкм. Для постановки иммуносерологических тестов, таких как иммуноферментный анализ (ИФА), реакция непрямой гемагглютинации (РИГА), реакция латекс-агглютинации (ЛАГ), а также для реакции биологической нейтрализации токсина на белых мышах (РБН) при обработке исследуемых материалов ограничиваются одним лишь центрифугированием.

Для культуральных посевов используется нативный жидкий материал, или предварительно суспендированный в физиологическом растворе. Для обеспечения ингибиции посторонней микрофлоры, мешающей выявлению С. difficile, подготовленный материал подвергают алкогольному шоку путем смешивания его в соотношении 1:1 с абсолютным этанолом и экспонирования в течение часа при комнатной температуре, после чего делается посев.

2. Методы и схема исследования на наличие токсинов и бактерий С. difficile. Поскольку заболевания у человека вызывают только токсигенные С. difficile, первостепенным и важным является обнаружение токсинов в клинических образцах. Как известно, С. difficile продуцирует токсический комплекс, содержащий два особо патогенетически важных компонента: токсин А (энтеротоксин) и токсин В (цитотоксин). Оба токсина обладают цитотоксической активностью, которая у токсина В в 100-1000 раз выше, чем у токсина А, тогда как летальная активность токсина А в 50-400 раз превышает таковую токсина В. Следовательно, в цитотесте по чувствительности и скорости выявления преимуществом обладает токсин В, а в летальных тестах — токсин А.

Это определило основные подходы в тактике проведения лабораторного исследования патологических материалов от больных, заключающейся в параллельном исследовании на наличие токсинов С. difficile и на выделение копрокультуры возбудителя с оценкой его токсигенности.

Схема исследования включает два параллельных направления:

I. Токсикологический анализ по экспресс-определению в фекалиях больных токсинов (АВ, А и В) С. difficile.

II. Микробиологический анализ по выделению из материалов от больных С. difficile и определению их токсигенности.

Исследуемый материал в нативном виде или разведенном 1:1 физиологическим раствором (pH -7,2) делится на две части и одновременно исследуется по этим двум направлениям.

Для токсикологического анализа материал центрифугируется при 6-7 тыс. об/мин. 25-30 минут при температуре 4°С. Надосадочная жидкость делится на две части: одна часть подвергается ультрафильтрации через фильтр «Millipore» 0,22 или 0,45 мкм и используется для обнаружения цитопатогенной активности (ЦПТ) токсина В в тесте на культуре клеток. Вторая часть исходного цен грифугата испытывается на наличие летальной активности токсина в реакции биологической нейтрализации (РБН) на белых мышах, а также на наличие токсина А и комплекса АВ в РНГА, реакция коагглютинации (РКоа), ИФА и других методах. Все тесты сопровождаются постановкой реакции нейтрализации с диагностическими антитоксическими сыворотками диффициле.

Методика постановки и учета РБН хорошо известна, довольно проста и позволяет быстро получить аналитический ответ. Принцип постановки РБН заключается во взаимодействии токсина и соответствующего антитоксина сыворотки in vitro и проявлении нейтрализующего токсин эффекта in vivo, обычно на белых мышах массой 14-16 г. Техника постановки РБН идентична для всех видов клостридиальных токсинов:

• в первую пробирку (опыт) вносят 1,5 мл испытуемого материала и 0,75 мл антитоксической сыворотки диффициле активностью 5-10 МЕ/мл;

• во вторую пробирку (контроль) вносят 1,5 мл испытуемого материала и 0,75 мл физиологического раствора.

После экспозиции 30-40 мин при комнатной температуре смесь вводят внутрибрюшинно двум белым мышам одним шприцом по 0,75 мл сначала из контрольной, затем из опытной пробирки. Учет результатов ведется через 3, 6 и 24 часа. В случае гибели контрольных животных и выживания опытных, РБН считается положительной, а вид использованной для нейтрализации сыворотки указывает на вид искомого токсина.

Помимо РБН, для индикации АВ-токсина С. difficile, а также А-токсина и В-токсина в отдельности применяют ряд чувствительных и специфичных иммуносерологических тестов. Цитопатогенный тест (ЦПТ) в совокупности с реакцией нейтрализации со специфической сывороткой, с помощью которого была впервые определена роль токсина С. difficile при ЭКД, в настоящее время получил широкое распространение при диагностике этих заболеваний. Для постановки теста используются коммерческие тест-системы, куда входят микропланшеты с культурой клеток определенных линий, специфический антитоксин, буфер и другие реактивы.

В связи с высокой цитотоксической активностью токсина В, в 1000 раз превосходящей токсин А, ЦПТ является очень хорошим индикатором присутствия в исследуемом образце не только токсина В, но и всего АВ комплекса С. difficile. Для постановки ЦПТ пригодны различные культуры клеток (HeLa, СНО, фибробласты эмбриона человека различных линий), тест проводят по методике, общепринятой в вирусологической практике. Присутствие токсина устанавливается по наличию цитотоксического эффекта (округление клеток монослоя) и отсутствию его в контроле со специфической сывороткой.

Показано, что ЦПТ обладает высокой специфичностью (70-100%), ибо антитоксическая сыворотка нейтрализует цитопатогенный эффект как токсина В, так и токсина А С. difficile. Чувствительность метода ниже, так как она иногда зависит от нестандартности методики постановки ЦПТ (способ обработки материала и условия его хранения, качество клеточных линий, субъективность оценки цитопатического эффекта и др.). Кроме того, высокая стоимость специального оборудования, длительность исследования (не менее 2-х суток), отсутствие возможности стандартизации делают этот метод не всегда целесообразным в условиях небольших клиник.

Часть исследователей и «Общество европейской эпидемиологической ассоциации» (1996) рекомендуют применять этот метод в сочетании с бактериологическим для достижения оптимальной чувствительности и специфичности.

Иммуноферментный анализ (ИФА) наряду с ЦПТ, получил довольно широкое распространение при диагностике ЭКД после того как были изготовлены коммерческие тест-системы, признанные достаточно чувствительными и специфичными, позволяющими определять в фецес токсин А или одновременно комплекс — токсины АВ.

Сравнительные испытания показали совпадение положительных результатов, полученных с помощью ИФА, культурального исследования и ЦПТ по чувствительности в 63-94% случаев, по специфичности — в 75-100%.

К преимуществам ИФА относятся простота и доступность использования, быстрота получения аналитического ответа (2-3 часа), специфичность и относительно невысокая стоимость.

В качестве скрининг-метода определения С. difficile при эпидемиологическом обследовании пациентов в 1997 году американскими исследователями разработана тест-система для ИФА, способная определять глутаматдегидрогеназу — часть белкового комплекса энтеротоксина С. difficile. Эта тест-система позволяет уже через 15-20 минут получить и оценить результат анализа, а также несколько повысить его чувствительность и специфичность.

Реакция непрямой гемагглютинации (РИГА), как метод определения токсинов и токсигенных С. difficile, была отработана нами на основе антитоксических и антиэнтеротоксических сывороток, полученных к цельному токсину (АВ) и энтеротоксину (А) С. difficile.

В связи с отсутствием на тот период в литературе данных об использовании РНГА для диагностики энтероклостридиозов диффициле нами было первоначально предпринято изучение чувствительности и специфичности полученного диагностикума иммуноглобулинового эритроцитарного энтеродиффицеле (ДИЭЭД). Испытание ДИЭЭД с семью штаммами С. difficile показало положительный результат со всеми штаммами в разведении от 1:256 до 1:2048, контрольный стандартизованный энтеротоксин в концентрации 1 мкг/мл давал положительный результат в разведении 1:1024, то есть чувствительность РИГА составила около 1-2 нг/мл.

Специфичность ДИЭЭД была оценена с четырнадцатью штаммами возбудителей кишечных инфекций и газовой гангрены, а также с токсинами (столбнячный, сорделлии, септикум, альфа-токсин перфрингенс, энтеротоксин перфрингенс, стафилококковый энтеротоксин), при этом только в двух случаях (С. perfnngens и его альфа-токсин) были отмечены слабоположительные результаты в разведении 1:8-1:16.

Далее метод РНГА с ДИЭЭД применялся нами для экспериментальной работы и для анализа поступавших клинических материалов (вспышка ЭКД и др.). К сожалению, в настоящее время не налажен производственный выпуск тест-систем для РНГА.

Кроме того, с использованием антисыворотки к токсину диффициле была испытана реакция коагглютинации (РКоа) для тестирования различных материалов от больных (центрифугаты кишечного содержимого, культуральная жидкость посевов, высевы из колоний), что показало перспективность этого метода в качестве очень быстрого (2-3 минуты) отборочного, ориентировочного для обнаружения токсигенных С. difficile с обязательным последующим подтверждением в других тестах.

Сходная по механизму действия реакция латекс-агглютинации (ЛА), судя по данным литературы, может быть использована только в скрининговых исследованиях, так как не дает возможности дифференцировать токсигенные и нетоксигенные штаммы С. difficile.

Весьма перспективный современный метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) пока не находит применения в практических клинических лабораториях ввиду его высокой стоимости и недостаточной оснащенности по сравнению с другими методами диагностики ЭКД. В дальнейшем, однако, по мнению ряда американских и японских авторов, ПЦР найдет более широкое применение для выявления токсигенных С. difficile.

В наших экспериментах (Ю.В. Вертиев и др., 2000) с применением праймеров к гену токсина А была изучена чувствительность ПЦР на четырех штаммах С. difficile, специфичность метода — на 26 штаммах клостридий (С. perfnngens, С. oedematicus, С. sordetlii, С. sporogenes, С. botulinum). При этом показано, что все токсигенные штаммы С. difficile дали положительный результат: выявляемость в образце была установлена примерно для 100 микробных клеток анализируемой культуры. Специфичность метода оказалась очень высокой: ни один из испытанных 26 штаммов не дал положительного результата в ПЦР.

Учитывая то, что существующие иммуносерологические методы несколько отстают по чувствительности и специфичности от микробиологических, поиск новых, быстрых и сравнительно простых методов диагностики ЭКД является весьма перспективным и своевременным.

Микробиологический анализ включает в себя как обязательный момент, необходимый для обеспечения преимуществ для культивирования С. difficile, алкогольное шокирование посторонней микрофлоры путем экспозиции исходного материала в соотношении 1:1 с абсолютным алкоголем в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем делают посев на плотные питательные среды, выращивают в анаэробных условиях при 37°С в течение 48-72 часов, и на жидкие питательные среды с добавками (циклосерин — 250 мкг/мл и цефокситин — 8 мкг/мл), инкубация при 37°С в течение 48-72 ч.

В качестве жидких питательных сред используют: сердечно-мозговой бульон «Difco», мясо-сердечный бульон «Difco», среду из отечественных компонентов — СТД и бульон Вейнберга. Плотные питательные среды готовятся на тех же бульонах с добавлением 1,5 % агара, 5 % крови барана и селективных добавок в виде смеси антибиотиков (на 1 мл среды 250 мкг циклосерина и 8 мкг цефокситина), которые вносят в среду перед розливом в чашки. Кроме того, существует готовая среда (CCFA), содержащая в своей агаризованной основе фруктозу, а также комбинацию циклосерина с цефокситином. По имеющимся данным, с помощью селективной среды CCFA удавалось изолировать возбудителей ЭКД из 90-100 % фекальных проб, содержавших цитотоксин С. difficile.

На жидких средах рост С. difficile начинается спустя 24-48 часов инкубации при 37°С. Сразу же готовят мазки с окраской по Граму, при обнаружении грамположительных палочек с закругленными концами, а также клеток с овальными субтерминально или терминально расположенными спорами; делают пересев на плотные селективные питательные среды.

На поверхности плотных питательных сред через 72 часа С. difficile образуют желтоватые, круглые, непрозрачные колонии размером 2-5 мм в диаметре, на кровяном агаре зона гемолиза отсутствует, на яично-желточном агаре колонии липазонегативны и обладают запахом «скотного двора».

Все колонии в ультрафиолетовом свете флуоресцируют. На кровяном агаре отмечается желто-зеленая флуоресценция, на CCFA — золотисто-желтая.

Из характерных колоний делают пересев на жидкую питательную среду для выделения чистой культуры и дальнейшей ее идентификации по биохимическим показателям в тест-системе «СИБ» или «АР1-20А», а также по токсигенным свойствам.

Токсигенность С. difficile определяют после 3-5 суточного культивирования на жидкой питательной среде путем обнаружения в культуральной жидкости токсинов с помощью вышеописанных тестов.

Весь процесс выделения и идентификации С. difficile занимает не менее 5-7 суток.

3. Критерии диагностики ЭКД:
• обнаружение в фецес от больного токсина (токсинов) С. difficile в сочетании с характерными клиническими симптомами и данными инструментального исследования толстого кишечника указывает на ЭКД;
• выделение из фецес больных токсигенных С. difficile является дополнительным признаком наличия ЭКД.

4. Современные методы типирования штаммов С. difficile. В целях проведения эпидемиологического расследования внутрибольничных вспышек ЭКД (обнаружение и характер распространения новых штаммов, контроль циркуляции возбудителя внутри клиник и в масштабе больших территорий, выявление путей передачи возбудителя и др.) необходимо использование методов, позволяющих с высокой точностью обнаружить межштаммовые различия С. difficile.

К числу современных методов типирования С. difficile, получивших наибольшее распространение, относят рестрикционный анализ (REA), электрофорез в пульсирующем поле (PFGE) и риботипирование с помощью ПЦР (PCR ribotyping, англ.).

При рестрикционном анализе хромосомная ДНК С. difficile обрабатывается эндонуклеазой HindIII и анализируется с использованием агарозного геля. ДНК расщепляется на фрагменты разного размера, при этом электрофореграммы разных штаммов могут существенно отличаться по характеру полос, анализируемых глазом. К сожалению, этот метод не получил широкого распространения для типирования штаммов С. difficile ввиду невозможности автоматической обработки и хранения результатов.

Электрофорез в пульсирующем поле был в числе первых методов, использованных для анализа штаммов С. difficile и остается на сегодня основным методом типирования данных микроорганизмов в США, Японии и других странах. В этом методе ДНК возбудителя обрабатывается эндонуклеазой рестрикции Smal (реже — SacII) и подвергается электрофорезу с высоким разрешением крупных фрагментов. Расщепление ДНК штаммов С. difficile дает 7-15 фрагментов размером 10-1100 тис. п.н., позволяющих легко идентифицировать межштаммовые различия. Штаммы, проявляющие идентичность свыше 80%, относят к одному «пульсотипу» (например, North American Pulsotype NAP1, NAP2 и др.).

Принцип метода риботипирования с помощью ПЦР основан на амплификации региона хромосомной ДНК между генами, кодирующими 16S и 23S рРНК. Ввиду того что оперон, кодирующий рРНК, присутствует в хромосоме С. difficile в нескольких копиях, использование одной пары праймеров приводит к амплификации нескольких фрагментов, которые выявляются с помощью агарозного геля. Полученные ампликоны могут быть анализированы визуально или с помощью специальных компьютерных программ (BioNumerics, Applied Maths). Данный метод является стандартным способом типирования и характеризации штаммов возбудителя ЭКД в Европе и позволяет сравнивать изоляты С. difficile, полученные в разных лабораториях мира, между собой и с коллекцией референс штаммов, хранящихся в Anaerobe Reference Unit, Cardiff, UK.

Международная база данных в настоящее время содержит более 200 риботипов, идентифицируемых трехзначными номерами (001, 002 и т.д.). Недавно был разработан новый метод риботипирования, основанный на капиллярном электрофорезе ампликонов. Новый метод, вероятно, облегчит сравнение результатов ПЦР риботипирования, полученных в разных лабораториях.

Учитывая важную роль токсинов А и В С. difficile в патогенезе ЭКД, весьма перспективным способом характеризации штаммов возбудителя можно назвать «токсинотипирование», то есть определение межштаммовых различий по различиям в структуре генов, кодирующих глюкозилирующие токсины. На сегодня известны 27 токсинотипов С. difficile, число которых, впрочем, постоянно увеличивается.

Очень высокую степень разграничения штаммов дает сочетание методов — например, риботипирование и токсинотипирование.

Современные методы типирования позволяют выявить появление нового гипервирулентного штамма С. difficile. Именно такой новый штамм зарегистрирован под типом BI/NAP1/027 (продуцирующий бинарный токсин CDT), который характеризуется эпидемическим распространением в клиниках США и Европы.

Внедрение методов типирования С. difficile в клиническую практику позволит проследить так называемую эпидемиологическую цепочку распространения этого нозокомиального патогена в больничных условиях, что поможет наладить целенаправленные меры профилактики ЭКД.

- Читать далее "Лечение и профилактика антибиотикоиндуцированных энтероклостридиозов диффициле (C. difficile)"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 26.4.2020

Остались вопросы или замечания?

Все размещенные статьи преследуют образовательную цель и предназначены для лиц имеющих базовые знания в области медицины.
Без консультации лечащего врача нельзя применять на практике любой изложенный в статье факт.
Жалобы и возникшие вопросы просим присылать на адрес statii@dommedika.com
На этот же адрес ждем запросы на координаты авторов статей - быстро их предоставим.